Original Title: A novel, virus-like double-stranded RNA in Phytopythium cucurbitacearum isolated from para rubber tree (Hevea brasiliensis) in eastern Thailand
Source: doi.org/10.34044/j.anres.2020.54.2.09
Disclaimer: Summary generated by AI based on the provided document. Please refer to the original paper for full scientific accuracy.

RNA ច្រវាក់ទ្វេស្រដៀងវីរុសថ្មីមួយនៅក្នុងមេរោគផ្សិត Phytopythium cucurbitacearum ដែលត្រូវបានបំបែកចេញពីដើមកៅស៊ូ (Hevea brasiliensis) នៅភាគខាងកើតប្រទេសថៃ

ចំណងជើងដើម៖ A novel, virus-like double-stranded RNA in Phytopythium cucurbitacearum isolated from para rubber tree (Hevea brasiliensis) in eastern Thailand

អ្នកនិពន្ធ៖ Chanoknan Hattapanichaporn (Chulalongkorn University), Wanatchaporn Hakhunthod (Chulalongkorn University), Atchawat Wongkasemsiri (Chulalongkorn University), Wanchai Assavalapsakul (Chulalongkorn University), Thanyanuch Kriangkripipat (Chulalongkorn University)

ឆ្នាំបោះពុម្ព៖ 2020, Agriculture and Natural Resources

វិស័យសិក្សា៖ Plant Pathology

១. សេចក្តីសង្ខេបប្រតិបត្តិ (Executive Summary)

បញ្ហា (The Problem)៖ ជំងឺជ្រុះស្លឹកខុសប្រក្រតី (Abnormal leaf fall) ដែលបង្កឡើងដោយមេរោគផ្សិត (Oomycetes) គឺជាបញ្ហាប្រឈមធំមួយសម្រាប់ដំណាំកៅស៊ូ ប៉ុន្តែគេនៅមិនទាន់មានសេចក្តីរាយការណ៍ពីវីរុសដែលរស់នៅជាមួយមេរោគផ្សិតនេះនៅលើដើមកៅស៊ូនៅឡើយទេ។

វិធីសាស្ត្រ (The Methodology)៖ ការសិក្សានេះបានធ្វើការបំបែកសំណាកមេរោគផ្សិតពីដើមកៅស៊ូដែលឈឺ និងប្រើប្រាស់វិធីសាស្ត្រវិភាគម៉ូលេគុលដើម្បីស្វែងរកវីរុស RNA ច្រវាក់ទ្វេ (dsRNA)។

ការបំបែកសំណាកមេរោគផ្សិត (Oomycetes Isolation)
ការទាញយកនិងវិភាគ dsRNA តាមរយៈក្រូម៉ាតូក្រាហ្វី (Cellulose Column Chromatography)
ការធ្វើតេស្តប្រតិកម្មអង់ស៊ីម (RNase A and S1 Nuclease Treatment)
ការវិភាគហ្សែនតាមរយៈ RT-PCR និង ITS Sequencing (Molecular Identification)

លទ្ធផលសំខាន់ៗ (The Verdict)៖

ក្នុងចំណោមសំណាកទាំង ៧៩ មានតែសំណាក Phytopythium cucurbitacearum មួយប៉ុណ្ណោះ (R84) ដែលមានផ្ទុក dsRNA ស្រដៀងវីរុសចំនួន ៣ កំណាត់ (៨.០, ៣.៧ និង ២.៣ គីឡូបាស)។
ការវិភាគហ្សែនតាមរយៈ RT-PCR បានបញ្ជាក់ថា dsRNA ទាំងនេះមិនមែនជាប្រភេទវីរុស Phytophthora ដែលធ្លាប់បានរាយការណ៍កន្លងមកនោះទេ ដែលបញ្ជាក់ថាវាជាប្រភេទថ្មី។
ការធ្វើតេស្តអត្រាកំណើន ការបន្តពូជ និងការឆ្លងជំងឺលើស្លឹក បានបង្ហាញថាការឆ្លង dsRNA នេះមានលក្ខណៈស្រងូតស្រងាត់ (Cryptic) ដោយមិនបានបង្កជារោគសញ្ញាអ្វីគួរឱ្យកត់សម្គាល់ដល់មេរោគផ្សិតនោះឡើយ។

២. ការវិភាគលើប្រសិទ្ធភាព និងដែនកំណត់ (Performance & Constraints)

វិធីសាស្ត្រ (Method)	គុណសម្បត្តិ (Pros)	គុណវិបត្តិ (Cons)	លទ្ធផលគន្លឹះ (Key Result)
Cellulose Column Chromatography ការចម្រាញ់ RNA ច្រវាក់ទ្វេដោយប្រើក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីសែលុយឡូស	ជាវិធីសាស្ត្រមានប្រសិទ្ធភាព និងចំណាយតិចក្នុងការញែក dsRNA របស់វីរុសចេញពីអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីករបស់មេរោគផ្សិត (Host)។	ទាមទារការយកចិត្តទុកដាក់ខ្ពស់លើការគ្រប់គ្រងកម្រិតអំបិល (Salt concentration) ហើយចំណាយពេលយូរក្នុងការអនុវត្ត។	អាចទាញយកបានកំណាត់ dsRNA ថ្មីចំនួន ៣ ទំហំ ៨.០, ៣.៧ និង ២.៣ គីឡូបាស ដោយជោគជ័យ។
Two-step RT-PCR ប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ប៉ូលីមេរ៉ាសច្រវាក់បញ្ច្រាសចំនួនពីរជំហាន	មានភាពរសើបខ្ពស់ (High sensitivity) ក្នុងការចាប់យកហ្សែនគោលដៅ និងអាចបញ្ជាក់អត្តសញ្ញាណវីរុសដែលគេស្គាល់រួចហើយបានយ៉ាងច្បាស់លាស់។	មិនអាចចាប់យក ឬកំណត់អត្តសញ្ញាណវីរុសប្រភេទថ្មីបានទេ ប្រសិនបើគ្មានព័ត៌មានហ្សែនជាមុន (Prior sequence knowledge) ដើម្បីបង្កើត Primers។	បានបញ្ជាក់ថា dsRNA ដែលរកឃើញមិនមែនជាប្រភេទវីរុស Phytophthora ដែលធ្លាប់មានរបាយការណ៍កន្លងមកនោះទេ (គ្មាន Band ផុសឡើងក្នុងតេស្ត)។
Nuclease Digestion (RNase A and S1 Nuclease) ការរំលាយដោយអង់ស៊ីមនុយក្លេអាស (RNase A និង S1 Nuclease)	ជាវិធីសាស្ត្រដ៏ច្បាស់លាស់ដើម្បីបញ្ជាក់ពីរចនាសម្ព័ន្ធរបស់អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីក (ថាតើវាជា DNA, ssRNA ឬ dsRNA)។	ត្រូវការសីតុណ្ហភាព និងលក្ខខណ្ឌសូលុយស្យុងបណ្ដោះ (Buffer) សមស្របដើម្បីចៀសវាងការរំលាយខុសគោលដៅ ដែលអាចធ្វើឱ្យបាត់បង់សំណាក។	បានបញ្ជាក់យ៉ាងច្បាស់ថាសំណាកនុយក្លេអ៊ីកដែលទាញយកបានគឺជា dsRNA ពិតប្រាកដ ដោយវាធន់នឹង S1 nuclease និង RNase A ក្នុងលក្ខខណ្ឌអំបិលកំហាប់ខ្ពស់។

ការចំណាយលើធនធាន (Resource Cost)៖ ការសិក្សានេះទាមទារនូវសម្ភារៈមន្ទីរពិសោធន៍ជីវសាស្ត្រម៉ូលេគុលកម្រិតមធ្យម សារធាតុគីមីជាក់លាក់ និងសេវាកម្មអានលំដាប់ហ្សែនពីខាងក្រៅ។

Laboratory Hardware: ត្រូវការម៉ាស៊ីន PCR (Thermal Cycler), ឧបករណ៍វិភាគ DNA (Agarose Gel Electrophoresis), និងម៉ាស៊ីនបញ្ចេញពន្លឺ UV (UV transilluminator)។
Chemical Reagents: ម្សៅ Cellulose fiber, អង់ស៊ីម (RNase A, S1 Nuclease, DNase I), ឈុតកាត់តហ្សែន (RT-PCR kits, TA cloning kit), មជ្ឈដ្ឋានចិញ្ចឹមមេរោគ (V8 Agar) និងថ្នាំកម្ចាត់ផ្សិត Hymexazol។
External Services: សេវាកម្មអានលំដាប់ហ្សែន (DNA Sequencing Service) ឧទាហរណ៍ ក្រុមហ៊ុន Macrogen ដើម្បីអានលំដាប់ហ្សែន ITS។
Software Tools: ត្រូវការកម្មវិធីវិភាគទិន្នន័យជីវសាស្ត្រ ដូចជា Clustal Omega សម្រាប់ការតម្រៀបហ្សែន និង MEGA X សម្រាប់គូសគំនូសតាងវិវត្តន៍ (Phylogenetic tree)។

៣. ការពិនិត្យសម្រាប់បរិបទកម្ពុជា/អាស៊ីអាគ្នេយ៍

ភាពលំអៀងនៃទិន្នន័យ (Data Bias)៖

ការសិក្សានេះប្រមូលសំណាកពីចម្ការកៅស៊ូចំនួន ១៥ កន្លែងនៅខេត្តភាគខាងកើតប្រទេសថៃ (រ៉ាក់យ៉ង ចាន់បុរី និងត្រាត)។ ទិន្នន័យនេះមានសារៈសំខាន់ណាស់សម្រាប់ប្រទេសកម្ពុជា ព្រោះតំបន់ទាំងនេះមានអាកាសធាតុស្រដៀងគ្នា និងមានព្រំប្រទល់ជិតស្និទ្ធ ដែលបង្ហាញពីលទ្ធភាពខ្ពស់នៃការឆ្លងរាលដាលជំងឺមេរោគផ្សិតឆ្លងដែនមកកាន់ដំណាំកសិកម្មកម្ពុជា។

លទ្ធភាពនៃការអនុវត្ត (Applicability)៖

វិធីសាស្ត្រ និងរបកគំហើញនៃការសិក្សានេះ មានប្រយោជន៍យ៉ាងខ្លាំងសម្រាប់វិស័យកសិកម្ម និងការគ្រប់គ្រងជំងឺរុក្ខជាតិនៅក្នុងប្រទេសកម្ពុជា។

វិស័យដំណាំកៅស៊ូ (ខេត្តត្បូងឃ្មុំ កំពង់ចាម រតនគិរី): វិទ្យាស្ថានស្រាវជ្រាវកៅស៊ូកម្ពុជា (CRRI) អាចប្រើប្រាស់វិធីសាស្ត្រនេះ ដើម្បីតាមដាន និងវិភាគរកមេរោគផ្សិត Phytopythium cucurbitacearum ដែលអាចបង្កជាជំងឺជ្រុះស្លឹកខុសប្រក្រតី (Abnormal leaf fall) លើដើមកៅស៊ូនៅកម្ពុជា។
វិស័យដំណាំទុរេន (ខេត្តកំពត កែប កោះកុង): ឯកសារបានបញ្ជាក់ថាមេរោគផ្សិតប្រភេទនេះ ក៏ពាក់ព័ន្ធនឹងជំងឺងាប់ដើមទុរេន (Tree-decline disease) ផងដែរ។ ដូច្នេះ អ្នកជំនាញកសិកម្មអាចអនុវត្តការស្រាវជ្រាវនេះ ដើម្បីការពារចម្ការទុរេនដែលកំពុងពង្រីកខ្លួនយ៉ាងឆាប់រហ័សនៅកម្ពុជា។
ការស្រាវជ្រាវវត្ថុបញ្ជាជីវសាស្ត្រ (Biocontrol Research): សាកលវិទ្យាល័យភូមិន្ទកសិកម្ម (RUA) អាចយកគំរូនៃការសិក្សា Mycovirus នេះ ដើម្បីបន្តស្វែងរកវីរុសផ្សិតប្រភេទផ្សេងទៀត ដែលអាចសម្លាប់ ឬបន្ថយភាពសាហាវរបស់មេរោគផ្សិត (Hypovirulence) សម្រាប់យកមកប្រើប្រាស់ជំនួសថ្នាំគីមី។

ជារួម ការអនុវត្តតាមវិធីសាស្ត្រវិភាគម៉ូលេគុលនេះ នឹងជួយពង្រឹងសមត្ថភាពរបស់កម្ពុជាក្នុងការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យជំងឺរុក្ខជាតិបានច្បាស់លាស់ និងទប់ស្កាត់ការខូចខាតទិន្នផលកសិកម្មទាន់ពេលវេលា។

៤. ផែនការសកម្មភាពសម្រាប់និស្សិត (Actionable Roadmap)

ដើម្បីអនុវត្តតាមការសិក្សានេះ និស្សិតគួរអនុវត្តតាមជំហានខាងក្រោម៖

រៀបចំ និងប្រមូលសំណាករុក្ខជាតិមានជំងឺ: ចុះប្រមូលសំណាកស្លឹកកៅស៊ូ ឬទុរេនដែលបង្ហាញរោគសញ្ញាជ្រុះស្លឹកខុសប្រក្រតីពីចម្ការគោលដៅ។ រក្សាសំណាកក្នុងថង់ប្លាស្ទិកនៅសីតុណ្ហភាព ១០-១៥°C និងអនុវត្តការក្រៀវផ្ទៃក្រៅ (Surface sterilization) មុនពេលចាប់ផ្តើមពិសោធន៍។
បណ្ដុះ និងញែកមេរោគផ្សិត (Oomycetes Isolation): កាត់សំណាកជាចំណិតតូចៗ ហើយដាក់បណ្ដុះនៅលើមជ្ឈដ្ឋាន 5% V8 Agar ដោយប្រើថ្នាំ Hymexazol ដើម្បីទប់ស្កាត់ការលូតលាស់របស់ផ្សិតដែលមិនមែនជាគោលដៅ។ បន្សុទ្ធមេរោគផ្សិតដែលដុះចេញមក (Pure culture)។
ចម្រាញ់ RNA និងធ្វើតេស្តបញ្ជាក់លក្ខណៈ: ទាញយកអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដោយប្រើបច្ចេកទេស Cellulose Column Chromatography។ បន្ទាប់មក ប្រើប្រាស់អង់ស៊ីម RNase A និង S1 Nuclease ក្នុងលក្ខខណ្ឌអំបិលខុសៗគ្នា រួចរត់លើ 1% Agarose Gel ដើម្បីបញ្ជាក់វត្តមានរបស់ dsRNA វីរុស។
កំណត់អត្តសញ្ញាណមេរោគតាមរយៈម៉ូលេគុល (Molecular Identification): ប្រើប្រាស់ម៉ាស៊ីន PCR ជាមួយ ITS1/ITS4 primers ដើម្បីពង្រីកហ្សែនរបស់មេរោគផ្សិត។ បញ្ជូនផលិតផល PCR ទៅក្រុមហ៊ុនដូចជា Macrogen ដើម្បីធ្វើ Sanger Sequencing រួចវិភាគលទ្ធផលដោយប្រើប្រាស់ NCBI BLAST និងកម្មវិធី MEGA X។
វាយតម្លៃឥទ្ធិពលវីរុសទៅលើមេរោគផ្សិត (Koch's Postulates): អនុវត្តតេស្ត Detached Leaf Assay ដោយចាក់បញ្ចូលសូលុយស្យុងស្ព័រ (Zoospores) ទៅលើស្លឹករុក្ខជាតិដែលមានសុខភាពល្អ ដើម្បីតាមដានអត្រានៃការបង្កជំងឺ។ ប្រៀបធៀបអត្រាលូតលាស់រវាងមេរោគផ្សិតដែលមានវីរុស និងគ្មានវីរុស ដោយប្រើកម្មវិធី IBM SPSS សម្រាប់វិភាគស្ថិតិ។

៥. វាក្យសព្ទបច្ចេកទេស (Technical Glossary)

ពាក្យបច្ចេកទេស	ការពន្យល់ជាខេមរភាសា (Khmer Explanation)	និយមន័យសាមញ្ញ (Simple Definition)
Oomycetes (អូមីសែត ឬមេរោគផ្សិតទឹក)	ជាក្រុមអតិសុខុមប្រាណម្យ៉ាងដែលមានលក្ខណៈរូបរាងនិងការរស់នៅស្រដៀងនឹងផ្សិត (Fungi) ប៉ុន្តែមានពូជអម្បូរនិងរចនាសម្ព័ន្ធហ្សែនជិតស្និទ្ធនឹងសារាយពណ៌ត្នោតច្រើនជាង ដោយពួកវាភាគច្រើនជាភ្នាក់ងារបង្កជំងឺយ៉ាងសាហាវដល់រុក្ខជាតិ។	ដូចជាចោរពាក់ម៉ាស់ដែលមើលទៅដូចជាមនុស្សធម្មតា (ផ្សិត) ប៉ុន្តែធាតុពិតពួកគេមកពីក្រុមផ្សេង ហើយបង្កការខូចខាតយ៉ាងដំណំដល់ដំណាំ។
Double-stranded RNA / dsRNA (RNA ច្រវាក់ទ្វេ)	ជាទម្រង់នៃសម្ភារៈសេនេទិច (ហ្សែន) របស់វីរុសមួយចំនួនដែលផ្សំឡើងពីខ្សែ RNA ពីររុំបញ្ចូលគ្នា ផ្ទុយពី RNA របស់ភាវៈរស់ធម្មតាដែលមានខ្សែតែមួយ (ssRNA) ដែលការរកឃើញវាបញ្ជាក់ពីវត្តមានរបស់វីរុសនៅក្នុងកោសិកា។	ដូចជាខ្សែរ៉ូតដែលត្រូវទាញភ្ជាប់សងខាងចូលគ្នា ខណៈដែល RNA ធម្មតាមានតែខ្សែម្ខាងប៉ុណ្ណោះ។
Cellulose column chromatography (ក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីដោយប្រើជួរសែលុយឡូស)	ជាបច្ចេកទេសក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍សម្រាប់បំបែក និងចម្រាញ់យកតែ dsRNA របស់វីរុសចេញពីល្បាយអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកចម្រុះរបស់កោសិកា ដោយពឹងផ្អែកលើប្រតិកម្មទាញទាញរវាងសែលុយឡូស និង dsRNA ក្នុងលក្ខខណ្ឌអំបិលជាក់លាក់។	ដូចជាការប្រើតម្រងពិសេសមួយដែលអាចចាប់យកតែគ្រាប់ខ្សាច់ធំៗ (dsRNA) ហើយបណ្ដោយឱ្យទឹកនិងធូលីតូចៗ (DNA/ssRNA) ហូរឆ្លងកាត់បាត់ទៅ។
RNase A (អង់ស៊ីម RNase A)	ជាប្រភេទអង់ស៊ីមដែលអាចកាត់ផ្តាច់ និងរំលាយខ្សែ RNA បែបច្រវាក់ទោល (ssRNA) ដែលគេប្រើវាដើម្បីធ្វើតេស្តបញ្ជាក់ថាអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដែលទាញយកបានពិតជា dsRNA (ច្រវាក់ទ្វេ) ព្រោះ dsRNA អាចធន់នឹងការរំលាយរបស់អង់ស៊ីមនេះក្នុងកំហាប់អំបិលខ្ពស់។	ដូចជាកន្ត្រៃដែលមុតអាចកាត់ដាច់តែក្រដាសមួយសន្លឹក (ssRNA) ប៉ុន្តែមិនអាចកាត់ដាច់សៀវភៅក្រាស់ (dsRNA) បានទេ។
Koch's postulates (គោលការណ៍កុស)	ជាជំហានវិទ្យាសាស្ត្រដើម្បីបញ្ជាក់ថាមេរោគជាក់លាក់ណាមួយពិតជាភ្នាក់ងារបង្កជំងឺមែន ដោយត្រូវយកមេរោគពីដើមឈឺ ទៅបណ្ដុះ រួចចាក់បញ្ចូលលើដើមជាសះស្បើយ តាមដានរោគសញ្ញា ហើយត្រូវញែកយកមេរោគដដែលនោះចេញមកវិញបាន។	ដូចជាការស៊ើបអង្កេតរកឃាតករ ដោយត្រូវចាប់ជនសង្ស័យពីកន្លែងកើតហេតុ ឱ្យធ្វើសកម្មភាពឡើងវិញ ហើយប្រៀបធៀបភស្តុតាងថាពិតជាជនដដែលមែនឬអត់។
Cryptic infection (ការឆ្លងបែបស្រងូតស្រងាត់)	គឺជាស្ថានភាពដែលវីរុសឆ្លងចូលទៅក្នុងកោសិកាមេរោគផ្សិត ហើយរស់នៅទីនោះដោយមិនបានបង្កជារោគសញ្ញា ឬមិនធ្វើឱ្យមេរោគផ្សិតនោះចុះខ្សោយ និងប្រែប្រួលសកម្មភាពនោះឡើយ។	ដូចជាមនុស្សមានផ្ទុកមេរោគផ្ដាសាយក្នុងខ្លួន ប៉ុន្តែមិនមានបញ្ចេញអាការៈក្អក ឬកណ្ដាស់អ្វីទាំងអស់ គឺនៅរស់នៅនិងធ្វើការងារបានធម្មតា។
Reverse transcription polymerase chain reaction / RT-PCR (ប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ប៉ូលីមេរ៉ាសច្រវាក់បញ្ច្រាស)	ជាបច្ចេកទេសម៉ូលេគុលដែលបំប្លែង RNA របស់វីរុសទៅជា DNA សិន មុននឹងធ្វើការថតចម្លង (តម្លើងចំនួន) ឱ្យបានច្រើន ដើម្បីអាចវិភាគ និងចាប់យកហ្សែនគោលដៅបានច្បាស់លាស់។	ដូចជាការបកប្រែឯកសារពីភាសាបារាំង (RNA) ទៅជាអង់គ្លេស (DNA) សិន ទើបយកទៅតម្កល់ទុកក្នុងម៉ាស៊ីនថតចម្លងរាប់ពាន់សន្លឹកងាយស្រួលអាន។
Phylogenetic analysis (ការវិភាគពង្សាវតារវិវត្តន៍)	ជាការប្រៀបធៀបលំដាប់ហ្សែន (DNA) របស់អតិសុខុមប្រាណដើម្បីសង់ជាគំនូសតាងមែកធាង ដែលបង្ហាញពីទំនាក់ទំនងញាតិសន្តាននិងការវិវត្តន៍របស់ពួកវា ជួយឱ្យគេស្គាល់អត្តសញ្ញាណមេរោគថ្មីៗ។	ដូចជាការគូសខ្សែស្រឡាយគ្រួសារ (Family tree) ដោយផ្អែកលើការធ្វើតេស្ត DNA ដើម្បីរកមើលថាតើនរណាជាបងប្អូនជីដូនមួយនឹងនរណា។

៦. ប្រធានបទពាក់ព័ន្ធ (Further Reading)

អត្ថបទដែលបានបោះពុម្ពនៅលើ KhmerResearch ដែលទាក់ទងនឹងប្រធានបទនេះ៖

ប្រធានបទ និងសំណួរស្រាវជ្រាវដែលទាក់ទងនឹងឯកសារនេះ ដែលអ្នកអាចស្វែងរកបន្ថែម៖