Original Title: The Verification of DNA Sequences Adjacent to LB of T-DNA in Transgenic Dendrobium ‘Sonia’ Earsakul Genome Using AL-PCR Technique
Source: li01.tci-thaijo.org
Disclaimer: Summary generated by AI based on the provided document. Please refer to the original paper for full scientific accuracy.

ការផ្ទៀងផ្ទាត់លំដាប់ DNA ដែលនៅជាប់នឹងព្រំដែនខាងឆ្វេង (LB) នៃ T-DNA នៅក្នុងហ្សែនផ្កាអ័រគីដេ Dendrobium 'Sonia' Earsakul បំប្លែងហ្សែន ដោយប្រើបច្ចេកទេស AL-PCR

ចំណងជើងដើម៖ The Verification of DNA Sequences Adjacent to LB of T-DNA in Transgenic Dendrobium ‘Sonia’ Earsakul Genome Using AL-PCR Technique

អ្នកនិពន្ធ៖ Pattama Sonsaka (Center for Agricultural Biotechnology, Kasetsart University), Piyanuch Sornchai (Biotechnology Research and Development Office, Department of Agriculture), Parichart Burns (National Center for Genetic Engineering and Biotechnology), Sontichai Chanprame (Center for Agricultural Biotechnology, Kasetsart University), Sermsiri Chanprame (Center for Agricultural Biotechnology, Kasetsart University)

ឆ្នាំបោះពុម្ព៖ 2021, Thai Agricultural Research Journal

វិស័យសិក្សា៖ Agricultural Biotechnology

១. សេចក្តីសង្ខេបប្រតិបត្តិ (Executive Summary)

បញ្ហា (The Problem)៖ ការស្រាវជ្រាវនេះដោះស្រាយបញ្ហានៃភាពមិនអាចទាយទុកជាមុនបាននៃទីតាំងបញ្ចូល T-DNA នៅក្នុងហ្សែនរុក្ខជាតិ កំឡុងពេលបំប្លែងហ្សែនដោយប្រើបាក់តេរី Agrobacterium ដែលវាអាចជះឥទ្ធិពលដល់ការបញ្ចេញហ្សែន និងលក្ខណៈសរីរវិទ្យា។

វិធីសាស្ត្រ (The Methodology)៖ ការសិក្សានេះបានប្រើប្រាស់បច្ចេកទេស Adaptor Ligation-Polymerase Chain Reaction (AL-PCR) ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណ និងផ្ទៀងផ្ទាត់លំដាប់ហ្សែននៅជុំវិញ T-DNA នៃផ្កាអ័រគីដេ។

ការកាត់សែន DNA របស់រុក្ខជាតិបំប្លែងហ្សែនដោយប្រើអង់ស៊ីមកាត់ PsiI (Restriction enzyme digestion)
ការតភ្ជាប់បំណែក DNA ជាមួយនឹង Adaptor (Adaptor ligation)
ការបង្កើនចំនួនបំណែក DNA គោលដៅតាមរយៈបច្ចេកទេស AL-PCR (Adaptor Ligation-Polymerase Chain Reaction)
ការវិភាគលំដាប់សែន DNA និងការប្រៀបធៀបទិន្នន័យ (DNA sequencing and analysis)

លទ្ធផលសំខាន់ៗ (The Verdict)៖

ការវិភាគដោយប្រើ AL-PCR បានបង្ហាញបំណែក DNA ចំនួន 3 ផ្សេងគ្នាគឺទំហំប្រមាណ 750, 1,500 និង 2,000 គូបាស (base pairs)។
ការវិភាគលំដាប់សែន DNA លើបំណែកទំហំ 750 bp បានបង្ហាញថា ផ្នែកនៃហ្សែន hpt ក្នុង T-DNA ត្រូវបានភ្ជាប់ទៅព្រំដែនខាងឆ្វេង (LB) ដែលបន្តភ្ជាប់ជាមួយលំដាប់ vector backbone ចំនួន 160 bp ចេញពីប្លាស្មីត។
ចំណែកឯបំណែកទំហំ 1,500 និង 2,000 bp មិនអាចយកមកវិភាគលំដាប់ DNA បានទេ ដោយសារកម្រិតភាពបរិសុទ្ធ និងបរិមាណរបស់វាទាបពេកមិនគ្រប់គ្រាន់។

២. ការវិភាគលើប្រសិទ្ធភាព និងដែនកំណត់ (Performance & Constraints)

វិធីសាស្ត្រ (Method)	គុណសម្បត្តិ (Pros)	គុណវិបត្តិ (Cons)	លទ្ធផលគន្លឹះ (Key Result)
Adaptor Ligation-Polymerase Chain Reaction (AL-PCR) បច្ចេកទេស AL-PCR (បង្កើនចំនួន DNA ដោយតភ្ជាប់ Adaptor)	អាចកំណត់អត្តសញ្ញាណ និងអានលំដាប់ DNA នៅតំបន់ព្រំដែនដែលមិនស្គាល់ (flanking sequences) ដោយប្រើប្រាស់លំដាប់ដែលស្គាល់តែមួយផ្នែកប៉ុណ្ណោះ ហើយមានភាពជាក់លាក់ខ្ពស់តាមរយៈប្រតិកម្ម Nested PCR។	ទាមទារការស្វែងរកអង់ស៊ីមកាត់ (Restriction enzyme) ដែលស័ក្តិសម ហើយអាចជួបបញ្ហាបំណែក DNA ធំៗមានបរិមាណ ឬភាពបរិសុទ្ធមិនគ្រប់គ្រាន់សម្រាប់ការអានលំដាប់សែន (Sequencing)។	កំណត់បានបំណែក DNA គោលដៅចំនួន៣ (750bp, 1500bp, 2000bp) និងបានបញ្ជាក់យ៉ាងជោគជ័យពីការតភ្ជាប់នៃ T-DNA ជាមួយនឹងផ្នែក vector backbone ប្រវែង 160bp នៅលើបំណែកទំហំ 750bp។
Southern Blot Analysis ការវិភាគសក្ដានុពលហ្សែនដោយបច្ចេកទេស Southern Blot (ការស្រាវជ្រាវមុន)	មានភាពជឿជាក់ខ្ពស់ក្នុងការកំណត់ចំនួនច្បាប់ចម្លង (Copy number) នៃហ្សែនដែលបានបញ្ចូលទៅក្នុងហ្សែនរបស់រុក្ខជាតិ។	ចំណាយពេលយូរ ត្រូវការបរិមាណ DNA សុទ្ធច្រើន និងមិនអាចផ្តល់ព័ត៌មានលម្អិតអំពីលំដាប់អក្សរ DNA (DNA sequence) នៅតំបន់ជុំវិញហ្សែនដែលបានបញ្ចូលនោះទេ។	ការសិក្សាមុនបានរកឃើញថា មានហ្សែនចំនួន ៤ច្បាប់ចម្លង (4 copies) ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងហ្សែននៃផ្កាអ័រគីដេខ្សែស្រឡាយ AE3 នេះ។

ការចំណាយលើធនធាន (Resource Cost)៖ ការអនុវត្តបច្ចេកទេសនេះទាមទារសម្ភារៈ និងឧបករណ៍មន្ទីរពិសោធន៍ជីវវិទ្យាម៉ូលេគុលកម្រិតមធ្យមទៅកម្រិតខ្ពស់ ព្រមទាំងចំណេះដឹងផ្នែកជីវព័ត៌មានវិទ្យា (Bioinformatics)។

Hardware: ម៉ាស៊ីនវាស់ស្ពិចត្រូហ្វូតូម៉ែត្រ (Spectrophotometer) សម្រាប់វាស់កំហាប់ DNA, ម៉ាស៊ីន PCR (Thermal cycler), និងឧបករណ៍សម្រាប់ធ្វើអេឡិចត្រូផូរ៉េស (Agarose gel electrophoresis)។
Reagents/Kits: អង់ស៊ីមកាត់ PsiI, T4 DNA Ligase, សារធាតុគីមី PCR (Taq polymerase, dNTPs), Adaptors, ព្រីម័រ (Primers), និងកញ្ចប់ GenepHlow Gel/PCR Kit សម្រាប់ចម្រាញ់ DNA ពីជែល។
Software/Bioinformatics: កម្មវិធីកុំព្យូទ័រសម្រាប់វិភាគទិន្នន័យលំដាប់ DNA ដូចជា MEGA6, SnapGene, និងប្រព័ន្ធ VecScreen របស់ទិន្នន័យ NCBI។
Services: សេវាកម្មខាងក្រៅសម្រាប់អានលំដាប់អក្សរ DNA (DNA Sequencing services) ដែលអាចទាមទារការបញ្ជូនសំណាកទៅក្រុមហ៊ុនជំនាញ។

៣. ការពិនិត្យសម្រាប់បរិបទកម្ពុជា/អាស៊ីអាគ្នេយ៍

ភាពលំអៀងនៃទិន្នន័យ (Data Bias)៖

ការសិក្សានេះត្រូវបានធ្វើឡើងនៅក្នុងប្រទេសថៃ (សាកលវិទ្យាល័យ Kasetsart និងនាយកដ្ឋានកសិកម្ម) ដោយផ្តោតលើពូជផ្កាអ័រគីដេបំប្លែងហ្សែន Dendrobium ‘Sonia’ Earsakul ។ ទោះបីជាសំណាកសិក្សាមានភាពជាក់លាក់ទៅលើប្រភេទផ្កាក៏ដោយ ប៉ុន្តែបច្ចេកទេស AL-PCR នេះគឺជាវិធីសាស្ត្រស្តង់ដារដែលអាចអនុវត្តបានយ៉ាងទូលំទូលាយលើរុក្ខជាតិបំប្លែងហ្សែនផ្សេងៗទៀត ដែលមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការអនុវត្តនៅប្រទេសកម្ពុជា។

លទ្ធភាពនៃការអនុវត្ត (Applicability)៖

បច្ចេកទេសនេះមានអត្ថប្រយោជន៍ និងសារៈសំខាន់ខ្លាំងសម្រាប់ប្រទេសកម្ពុជា ក្នុងការអភិវឌ្ឍសមត្ថភាពស្រាវជ្រាវផ្នែកជីវបច្ចេកវិទ្យាកសិកម្ម និងការគ្រប់គ្រងរុក្ខជាតិបំប្លែងហ្សែន (GMOs)។

វិទ្យាស្ថានស្រាវជ្រាវ និងអភិវឌ្ឍន៍កសិកម្មកម្ពុជា (CARDI): អាចអនុវត្តបច្ចេកទេសនេះដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់ និងតាមដានទីតាំងហ្សែននៅក្នុងពូជស្រូវ ឬដំណាំយុទ្ធសាស្ត្រផ្សេងៗដែលត្រូវបានស្រាវជ្រាវ ឬធ្វើការបំប្លែងហ្សែនដើម្បីធន់នឹងជំងឺ ឬអាកាសធាតុ។
ការគ្រប់គ្រងសុវត្ថិភាពជីវសាស្រ្ត (Biosafety Regulation): ជួយដល់ក្រសួងបរិស្ថាន និងក្រសួងកសិកម្ម រុក្ខាប្រមាញ់ និងនេសាទ ក្នុងការវាយតម្លៃហានិភ័យ និងត្រួតពិនិត្យដំណាំ GMO នាំចូល ឬសាកល្បងដាំដុះក្នុងស្រុក តាមរយៈការកំណត់អត្តសញ្ញាណទីតាំងនៃការកាត់តហ្សែន (Event-specific identification) បានយ៉ាងច្បាស់លាស់។
សាកលវិទ្យាល័យភូមិន្ទកសិកម្ម (RUA) និងមជ្ឈមណ្ឌលស្រាវជ្រាវ: ជាមូលដ្ឋានគ្រឹះដ៏ល្អសម្រាប់ការបណ្តុះបណ្តាលនិស្សិតថ្នាក់អនុបណ្ឌិត និងបណ្ឌិតផ្នែកជីវបច្ចេកវិទ្យា ឱ្យចេះប្រើប្រាស់វិធីសាស្ត្ររាវរកម៉ូលេគុលកម្រិតខ្ពស់។

ការពង្រឹងសមត្ថភាពលើបច្ចេកទេសនេះ នឹងជួយឱ្យកម្ពុជាមានឯករាជ្យភាពកាន់តែប្រសើរ ក្នុងការស្រាវជ្រាវកសិកម្មទំនើប និងការធានាសុវត្ថិភាពចំណីអាហារនិងជីវសាស្រ្ត។

៤. ផែនការសកម្មភាពសម្រាប់និស្សិត (Actionable Roadmap)

ដើម្បីអនុវត្តតាមការសិក្សានេះ និស្សិតគួរអនុវត្តតាមជំហានខាងក្រោម៖

សិក្សាមូលដ្ឋានគ្រឹះនៃបច្ចេកវិទ្យា DNA និងការបញ្ជូនហ្សែន: និស្សិតត្រូវស្វែងយល់ឱ្យបានច្បាស់ពីយន្តការនៃការបញ្ជូន T-DNA ដោយបាក់តេរី Agrobacterium tumefaciens, ធាតុផ្សំនៃ Vector (ដូចជា LB, RB, Vector backbone), និងគោលការណ៍នៃប្រតិកម្ម PCR ជាពិសេស Nested PCR។
រៀនសូត្រពីការប្រើប្រាស់កម្មវិធីជីវព័ត៌មានវិទ្យា (Bioinformatics): ត្រូវអនុវត្តការប្រើប្រាស់កម្មវិធីវិភាគទិន្នន័យ DNA ដូចជា MEGA6, SnapGene និងប្រព័ន្ធ VecScreen របស់ NCBI ដើម្បីស្វែងយល់ពីរបៀបរចនាព្រីម័រ (Primer design) និងការប្រៀបធៀបលំដាប់ DNA (Sequence alignment) ជាមួយនឹងទិន្នន័យស្តង់ដារ។
អនុវត្តការងារជាក់ស្តែងក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍ (Wet-lab Skills): ចាប់ផ្តើមហ្វឹកហាត់ពីការចម្រាញ់ Genomic DNA ពីរុក្ខជាតិ (ឧទាហរណ៍តាមវិធី CTAB) និងការកាត់ DNA ដោយប្រើ Restriction Enzymes ព្រមទាំងបច្ចេកទេសភ្ជាប់ Adaptors ដោយប្រើប្រាស់ T4 DNA Ligase។
ការធ្វើប្រតិបត្តិការ និងកែលម្អ AL-PCR (Optimization): អនុវត្តការធ្វើ Primary និង Secondary AL-PCR ដោយរៀនពីរបៀបផ្លាស់ប្តូរសីតុណ្ហភាពតភ្ជាប់ (Annealing temperature) វដ្ត (Cycles) និងការប្រើប្រាស់ Gel extraction kit ដើម្បីយកបំណែក DNA គោលដៅឱ្យបានបរិសុទ្ធ។
ការវិភាគលទ្ធផល និងការដោះស្រាយបញ្ហា (Troubleshooting): រៀនពីរបៀបបកស្រាយលទ្ធផលនៃការអានលំដាប់ DNA (Sequencing results) និងវិធីដោះស្រាយបញ្ហានៅពេលបំណែក DNA ទទួលបានមានបរិមាណតិច ឬភាពបរិសុទ្ធទាប (ដូចករណីបំណែក 1500bp និង 2000bp ក្នុងការសិក្សានេះ)។

៥. វាក្យសព្ទបច្ចេកទេស (Technical Glossary)

ពាក្យបច្ចេកទេស	ការពន្យល់ជាខេមរភាសា (Khmer Explanation)	និយមន័យសាមញ្ញ (Simple Definition)
T-DNA (ឌីអិនអេបញ្ជូន)	ជាផ្នែកមួយនៃ DNA ពីបាក់តេរី Agrobacterium tumefaciens ដែលត្រូវបានកាត់ និងបញ្ជូនទៅបញ្ចូលក្នុងសែន (Genome) របស់រុក្ខជាតិ ដើម្បីបង្កើតជារុក្ខជាតិបំប្លែងហ្សែន។	ដូចជាកញ្ចប់ទំនិញ (ហ្សែនថ្មី) ដែលភ្នាក់ងារផ្ញើអីវ៉ាន់ (បាក់តេរី) យកទៅប្រគល់ និងដាក់បញ្ចូលទៅក្នុងផ្ទះរបស់យើង (សែនរុក្ខជាតិ)។
AL-PCR (បច្ចេកទេសបង្កើនចំនួន DNA ដោយតភ្ជាប់អាដាប់ទ័រ)	ជាបច្ចេកទេសមួយសម្រាប់ស្វែងរក និងអានលំដាប់ DNA នៅតំបន់ដែលយើងមិនស្គាល់ (flanking sequence) ដោយកាត់ DNA ជាបំណែកៗ រួចភ្ជាប់វាទៅនឹងកន្ទុយ DNA មួយទៀតដែលយើងស្គាល់ (Adaptor) ដើម្បីអាចប្រើជាចំណុចចាប់ផ្តើមក្នុងការបង្កើនចំនួន (PCR) និងអានកូដ។	ដូចជាការយកខ្សែពួរដែលយើងស្គាល់ម៉ាក (Adaptor) ទៅចងបន្តជាមួយខ្សែពួរដែលយើងមិនស្គាល់ប្រភព ដើម្បីទាញយកខ្សែពួរដែលមិនស្គាល់នោះមកពិនិត្យមើល។
Vector backbone (ឆ្អឹងខ្នងវ៉ិចទ័រ / ផ្នែកប្លាស្មីតដែលមិនមែនជា T-DNA)	គឺជាផ្នែកនៃប្លាស្មីត (Plasmid) របស់បាក់តេរី ដែលនៅក្រៅរង្វង់ T-DNA។ ជាទូទៅវាមិនគួរត្រូវបានបញ្ជូនទៅក្នុងរុក្ខជាតិនោះទេ ប៉ុន្តែជួនកាលវាអាចជ្រាបចូលទៅជាមួយគ្នាក្នុងកំឡុងពេលបំប្លែងហ្សែន (co-transformation) បង្កើតបានជាលំដាប់ DNA លើសតម្រូវការ។	ដូចជារទេះរុញដែលប្រើសម្រាប់ដឹកទំនិញ (T-DNA) ទៅដាក់ក្នុងផ្ទះ តែជួនកាលគេភ្លេចទុកទាំងរទេះរុញនោះនៅក្នុងផ្ទះដែរ។
Flanking sequence (លំដាប់ DNA អមសងខាង)	គឺជាលំដាប់នៃ DNA ដើមរបស់រុក្ខជាតិ ដែលនៅជាប់ផ្ទាល់ជាមួយនឹងព្រំដែន (ខាងឆ្វេង ឬខាងស្តាំ) នៃហ្សែនបរទេស (T-DNA) ដែលទើបតែបានបញ្ចូលទៅ។ ការដឹងពីលំដាប់នេះជួយឱ្យអ្នកវិទ្យាសាស្ត្រដឹងថាហ្សែនថ្មីនោះទៅស្ថិតនៅទីតាំងណាពិតប្រាកដនៃសែនរុក្ខជាតិ។	ដូចជាការដឹងពីលេខផ្ទះអ្នកជិតខាងទាំងសងខាង ដើម្បីបញ្ជាក់ពីទីតាំងពិតប្រាកដនៃផ្ទះថ្មីមួយដែលទើបនឹងសាងសង់នៅកណ្តាល។
Restriction enzyme (អង់ស៊ីមកាត់ DNA)	ជាប្រភេទប្រូតេអ៊ីនម្យ៉ាង (អង់ស៊ីម) ដែលមានតួនាទីកាត់ខ្សែ DNA ឱ្យដាច់ជាបំណែកៗ នៅត្រង់ទីតាំងលំដាប់អក្សរ DNA ណាមួយដែលវាស្គាល់ជាក់លាក់ (ឧទាហរណ៍អង់ស៊ីម PsiI នៅក្នុងការសិក្សានេះ)។	ដូចជាកន្ត្រៃវេទមន្តដែលអាចកាត់ខ្សែបូបាន លុះត្រាតែវាឃើញពណ៌ និងម៉ូតអក្សរជាក់លាក់ណាមួយនៅលើខ្សែបូនោះ។
Agrobacterium-mediated genetic transformation (ការបំប្លែងហ្សែនដោយប្រើបាក់តេរី Agrobacterium)	ជាវិធីសាស្ត្របញ្ចូលហ្សែនថ្មីទៅក្នុងរុក្ខជាតិ ដោយពឹងផ្អែកលើសមត្ថភាពធម្មជាតិរបស់បាក់តេរីប្រភេទ Agrobacterium tumefaciens ក្នុងការចម្លង និងបញ្ចូលផ្នែក DNA របស់វាទៅក្នុងកោសិការុក្ខជាតិ ដើម្បីធ្វើការកាត់តហ្សែន។	ដូចជាការប្រើប្រាស់សត្វព្រាបនាំសារ ដែលមានសមត្ថភាពពីធម្មជាតិក្នុងការហោះហើរយកសំបុត្រ (ហ្សែនថ្មី) ទៅឱ្យអ្នកទទួលគោលដៅ (រុក្ខជាតិ)។
Left Border (ព្រំដែនខាងឆ្វេងនៃ T-DNA)	ជាលំដាប់ DNA ខ្លីមួយដែលស្ថិតនៅចុងបញ្ចប់ខាងឆ្វេងនៃ T-DNA។ វាដើរតួជាសញ្ញាប្រាប់អង់ស៊ីមរបស់បាក់តេរីឱ្យឈប់កាត់ត្រឹមនេះ ពេលកំពុងបង្កើតខ្សែ T-DNA ដើម្បីបញ្ជូនទៅរុក្ខជាតិ។ បើប្រព័ន្ធនេះរអាក់រអួល វានឹងនាំឱ្យមានការកាត់ហួសដល់ផ្នែក Vector backbone (ហៅថាបាតុភូត read-through)។	ដូចជាផ្លាកសញ្ញា 'ឈប់' (STOP) នៅចុងបញ្ចប់នៃផ្លូវ ដើម្បីប្រាប់អ្នកបើកបរឱ្យឈប់ត្រឹមហ្នឹង កុំឱ្យជ្រុលទៅមុខទៀត។

៦. ប្រធានបទពាក់ព័ន្ធ (Further Reading)

អត្ថបទដែលបានបោះពុម្ពនៅលើ KhmerResearch ដែលទាក់ទងនឹងប្រធានបទនេះ៖

ប្រធានបទ និងសំណួរស្រាវជ្រាវដែលទាក់ទងនឹងឯកសារនេះ ដែលអ្នកអាចស្វែងរកបន្ថែម៖