Original Title: Isolation of total DNA from bacteria and yeast
Source: doi.org/10.46882/FAFT/1218
Disclaimer: Summary generated by AI based on the provided document. Please refer to the original paper for full scientific accuracy.

ការទាញយក DNA សរុបពីបាក់តេរី និងមេដំបែ

ចំណងជើងដើម៖ Isolation of total DNA from bacteria and yeast

អ្នកនិពន្ធ៖ Marco Ligozzi, Dipartimento di Patologia, Università degli studi di Verona, Roberta Fontana, Dipartimento di Patologia, Università degli studi di Verona

ឆ្នាំបោះពុម្ព៖ 2020, Frontiers of Agriculture and Food Technology

វិស័យសិក្សា៖ Molecular Biology

១. សេចក្តីសង្ខេបប្រតិបត្តិ (Executive Summary)

បញ្ហា (The Problem)៖ ការស្រាវជ្រាវនេះដោះស្រាយបញ្ហានៃការទាញយកនិងបន្សុទ្ធសេនេទិច DNA ពីបាក់តេរី (ដូចជា Escherichia coli) និងមេដំបែ ដែលវិធីសាស្ត្រចាស់ៗតែងតែចំណាយពេលយូរ មានដំណាក់កាលច្រើន និងប្រើប្រាស់សារធាតុគីមីពុល។

វិធីសាស្ត្រ (The Methodology)៖ អ្នកស្រាវជ្រាវបានធ្វើការកែសម្រួលវិធីសាស្ត្រ DNAzol ដោយរួមបញ្ចូលការប្រើប្រាស់អង់ស៊ីមបំបែកជញ្ជាំងកោសិកាជាមុន រួចប្រើប្រាស់ជួរឈរស៊ីលីកា (Silica columns) សម្រាប់ការបន្សុទ្ធ។

ការប្រើប្រាស់អង់ស៊ីមបំបែកជញ្ជាំងកោសិកា (Cell-wall degrading enzymes) ដូចជា lysostaphin, lysozyme, mutanolysin, និង zymolyase
ការរំលាយកោសិកាដោយប្រើភ្នាក់ងារ DNAzol (DNAzol lysis reagent) ដែលមានផ្ទុក Guanidine thioisocyanate
ការបន្សុទ្ធតាមរយៈជួរឈរស៊ីលីកា (Silica particle column purification) និងការលាងសម្អាតដោយអេតាណុល (Ethanol washing)

លទ្ធផលសំខាន់ៗ (The Verdict)៖

វិធីសាស្ត្រថ្មីនេះមានភាពងាយស្រួលនិងលឿនជាងមុន ដោយចំណាយពេលត្រឹមតែ 0.75 ម៉ោងក្នុងការអនុវត្ត បើប្រៀបធៀបទៅនឹងវិធីសាស្ត្រទូទៅដែលទាមទាររយៈពេលចាប់ពី 2 ម៉ោងឡើងទៅ។
ទិន្នផល DNA ដែលទទួលបានមានកម្រិតខ្ពស់ និងមានភាពសុទ្ធល្អ ដោយមានអត្រា A260/280 ចន្លោះពី 1.8 ទៅ 2.0។
DNA ដែលទាញយកបានមានគុណភាពស័ក្តិសមបំផុតសម្រាប់ការប្រើប្រាស់បន្ត ដូចជាការកាត់ដោយអង់ស៊ីម Restriction, PCR, និង Southern blot ដោយមិនចាំបាច់ប្រើប្រាស់សារធាតុគីមីពុលឡើយ។

២. ការវិភាគលើប្រសិទ្ធភាព និងដែនកំណត់ (Performance & Constraints)

វិធីសាស្ត្រ (Method)	គុណសម្បត្តិ (Pros)	គុណវិបត្តិ (Cons)	លទ្ធផលគន្លឹះ (Key Result)
Modified DNAzol Method វិធីសាស្ត្រ DNAzol ដែលបានកែសម្រួល	ចំណាយពេលខ្លី (ត្រឹមតែ 0.75 ម៉ោង) ងាយស្រួលធ្វើ និងមិនប្រើប្រាស់សារធាតុគីមីពុល។ ផ្តល់ទិន្នផល DNA សុទ្ធល្អសម្រាប់ការអនុវត្តបន្តដូចជា PCR និង Restriction digestion។	ទាមទារការប្រើប្រាស់អង់ស៊ីមបំបែកជញ្ជាំងកោសិកាជាក់លាក់ជាមុន (ដូចជា lysozyme, zymolyase) ទៅតាមប្រភេទបាក់តេរី ឬមេដំបែ ដែលអាចបន្ថែមតម្លៃបន្តិចបន្តួច។	ទទួលបាន DNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់ (អត្រា A260/280 ចន្លោះពី 1.8 ទៅ 2.0) និងមានទិន្នផលពី 4.5 ដល់ 15 µg ក្នុង 1-1.5 ml នៃកោសិកាដើម។
Conventional Proteinase K and Phenol Extraction វិធីសាស្ត្រទាញយកដោយប្រើ Proteinase K និង Phenol	ជាវិធីសាស្ត្រស្តង់ដារដែលត្រូវបានប្រើប្រាស់ជាទូទៅតាំងពីយូរយារណាស់មកហើយ និងមានប្រសិទ្ធភាពក្នុងការបំបាត់ប្រូតេអ៊ីន។	ចំណាយពេលយូរ (ច្រើនជាង 2 ម៉ោង) មានដំណាក់កាលច្រើន ងាយធ្វើឱ្យបាត់បង់ ឬខូចគុណភាព DNA និងប្រើប្រាស់សារធាតុរំលាយសរីរាង្គដែលមានជាតិពុលខ្ពស់ (Phenol)។	ប្រើប្រាស់ពេលយូរ និងមានហានិភ័យខ្ពស់ក្នុងការបាត់បង់ DNA កំឡុងពេលទាញយកដោយសារធាតុរំលាយ (Solvent extraction) និងការធ្វើកំណក (Precipitation)។

ការចំណាយលើធនធាន (Resource Cost)៖ វិធីសាស្ត្រនេះតម្រូវឱ្យមានការប្រើប្រាស់អង់ស៊ីមបំបែកជញ្ជាំងកោសិកា ប្រព័ន្ធជួរឈរស៊ីលីកា (Silica columns) និងឧបករណ៍មន្ទីរពិសោធន៍ជីវវិទ្យាម៉ូលេគុលជាមូលដ្ឋាន។

Reagents: សារធាតុ DNAzol, សារធាតុរំលាយ TE buffer, និងអេតាណុល (Ethanol 70%) សម្រាប់ការលាងសម្អាតជួរឈរ។
Enzymes: អង់ស៊ីមបំបែកជញ្ជាំងកោសិកា (lysostaphin, lysozyme, mutanolysin, និង zymolyase) ដែលត្រូវនឹងប្រភេទអតិសុខុមប្រាណនីមួយៗ។
Equipment: ម៉ាស៊ីនបង្វិលកម្លាំងកណ្តាល (Microfuge), ប្រព័ន្ធជួរឈរបន្សុទ្ធ (Concert Rapid PCR Purification System columns), ឧបករណ៍កម្ដៅ (Incubator), និងឧបករណ៍វាស់ស្ទង់ Spectrophotometer។
Expertise: ចំណេះដឹងមូលដ្ឋានផ្នែកជីវវិទ្យាម៉ូលេគុល មីក្រូជីវសាស្រ្ត សម្រាប់ការបណ្តុះមេរោគ និងការអនុវត្តពិធីការទាញយក DNA។

៣. ការពិនិត្យសម្រាប់បរិបទកម្ពុជា/អាស៊ីអាគ្នេយ៍

ភាពលំអៀងនៃទិន្នន័យ (Data Bias)៖

ការសិក្សានេះត្រូវបានធ្វើឡើងនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍នៃសាកលវិទ្យាល័យ Verona ប្រទេសអ៊ីតាលី ដោយប្រើប្រាស់សំណាកមេរោគបាក់តេរីនិងមេដំបែដែលប្រមូលបានពីមន្ទីរពេទ្យ Ospedale Civile ព្រមទាំងមេរោគស្តង់ដារ ATCC។ ទោះបីជាប្រភេទអតិសុខុមប្រាណទាំងនេះ (ដូចជា Staphylococcus aureus ឬ Escherichia coli) មានជាទូទៅនៅទូទាំងពិភពលោកក៏ដោយ ការអនុវត្តនៅប្រទេសកម្ពុជាអាចតម្រូវឱ្យមានការសាកល្បងបន្ថែមលើប្រភេទបាក់តេរីក្នុងស្រុក ឬមេរោគដែលបង្កជំងឺនៅតំបន់ត្រូពិក ដើម្បីធានាបាននូវប្រសិទ្ធភាពអតិបរមា។

លទ្ធភាពនៃការអនុវត្ត (Applicability)៖

វិធីសាស្ត្រនេះមានសក្តានុពលខ្ពស់ និងអាចអនុវត្តបានយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាពសម្រាប់វិស័យស្រាវជ្រាវ និងការវិភាគផ្នែកវេជ្ជសាស្ត្រនៅប្រទេសកម្ពុជា ដោយសារចំណាយពេលខ្លី និងមិនប្រើសារធាតុពុល។

មន្ទីរពិសោធន៍សុខភាពសាធារណៈ (ឧទាហរណ៍ វិទ្យាស្ថានប៉ាស្ទ័រកម្ពុជា ឬ NIPH): អាចប្រើប្រាស់វិធីសាស្ត្រនេះដើម្បីទាញយក DNA ពីបាក់តេរីបង្កជំងឺបានលឿន ជួយពន្លឿនការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យជំងឺឆ្លង និងការសិក្សាពីភាពស៊ាំនឹងថ្នាំអង់ទីប៊ីយោទិច។
វិស័យកសិកម្ម និងសុវត្ថិភាពចំណីអាហារ: មានប្រយោជន៍សម្រាប់ការត្រួតពិនិត្យអនាម័យចំណីអាហារ ការរកឃើញបាក់តេរី ឬមេដំបែក្នុងផលិតផលកសិកម្ម ឬការសិក្សាពីមីក្រូជីវសាស្រ្តក្នុងដីនៅតាមខេត្តកសិកម្ម។
ស្ថាប័នស្រាវជ្រាវ និងសាកលវិទ្យាល័យ (ឧ. សាកលវិទ្យាល័យភូមិន្ទភ្នំពេញ): ស័ក្តិសមសម្រាប់និស្សិតនិងអ្នកស្រាវជ្រាវ ដោយសារវិធីសាស្ត្រនេះកាត់បន្ថយការចំណាយពេល មិនតម្រូវឱ្យមានការគ្រប់គ្រងកាកសំណល់គីមីពុលស្មុគស្មាញ និងមានសុវត្ថិភាពខ្ពស់ក្នុងការអនុវត្ត។

ជារួម ការផ្លាស់ប្តូរមកប្រើប្រាស់វិធីសាស្ត្រ DNAzol ដែលកែសម្រួលនេះ នឹងជួយកាត់បន្ថយពេលវេលា ហានិភ័យសុខភាព និងបង្កើនប្រសិទ្ធភាពក្នុងការទាញយក DNA សរុបនៅតាមមន្ទីរពិសោធន៍នានាក្នុងប្រទេសកម្ពុជា។

៤. ផែនការសកម្មភាពសម្រាប់និស្សិត (Actionable Roadmap)

ដើម្បីអនុវត្តតាមការសិក្សានេះ និស្សិតគួរអនុវត្តតាមជំហានខាងក្រោម៖

ការរៀបចំសារធាតុ និងអង់ស៊ីមចាំបាច់: បញ្ជាទិញសារធាតុ DNAzol, ជួរឈរបន្សុទ្ធ Silica Columns (ឧ. Concert Rapid PCR Purification System) និងអង់ស៊ីមបំបែកជញ្ជាំងកោសិកា (ដូចជា Lysozyme, Lysostaphin ឬ Zymolyase) ឱ្យស្របតាមប្រភេទបាក់តេរីដែលត្រូវសិក្សា។
ការបណ្តុះកោសិកាបាក់តេរី ឬមេដំបែ: អនុវត្តការបណ្តុះមេរោគនៅក្នុងមជ្ឈដ្ឋានត្រឹមត្រូវ (ឧទាហរណ៍ TSB សម្រាប់បាក់តេរី Gram-positive ឬ LB សម្រាប់ Gram-negative) រហូតទទួលបានកំហាប់កោសិកាគ្រប់គ្រាន់ បន្ទាប់មកប្រមូលកោសិកាដោយប្រើ Microfuge និងលាងសម្អាតជាមួយ TE buffer។
ការបំបែកកោសិកា (Cell Lysis): រំលាយកោសិកាដោយប្រើអង់ស៊ីមក្នុងសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 30 នាទី បន្ទាប់មកបញ្ចូលសារធាតុ DNAzol ចំនួន 500 µl ទៅក្នុងល្បាយ 100 µl ហើយរក្សាកម្តៅនៅ 65°C រយៈពេល 5 នាទី។
ការបន្សុទ្ធ DNA តាមរយៈជួរឈរ (Column Purification): ផ្ទេរសូលុយស្យុងទៅក្នុងជួរឈរបន្សុទ្ធ បង្វិលក្នុងល្បឿន 10,000 x g រយៈពេល 30-60 វិនាទី រួចលាងសម្អាតជាមួយអេតាណុល 70% ចំនួនពីរដង មុននឹងទាញយក DNA ជាមួយនឹងសូលុយស្យុង TE buffer ក្តៅ (65°C)។
ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព និងការប្រើប្រាស់បន្ត: ប្រើប្រាស់ឧបករណ៍ Spectrophotometer ដើម្បីវាស់អត្រា A260/280 និងដំណើរការ Agarose gel electrophoresis ដើម្បីបញ្ជាក់ពីភាពសុទ្ធនិងបរិមាណ DNA មុននឹងយកទៅអនុវត្តបន្តដូចជា PCR ឬ Molecular Cloning។

៥. វាក្យសព្ទបច្ចេកទេស (Technical Glossary)

ពាក្យបច្ចេកទេស	ការពន្យល់ជាខេមរភាសា (Khmer Explanation)	និយមន័យសាមញ្ញ (Simple Definition)
genomic DNA (ឌីអិនអេហ្សេណូម)	វាគឺជាបណ្តុំនៃសេនេទិច DNA ទាំងមូលដែលមាននៅក្នុងកោសិកាមួយ ដែលផ្ទុកនូវរាល់ព័ត៌មាននិងការណែនាំទាំងអស់ដែលចាំបាច់សម្រាប់ការលូតលាស់ និងដំណើរការរបស់ភាវៈរស់នោះ។	ដូចជាសៀវភៅមគ្គុទ្ទេសក៍ដ៏ធំមួយដែលមានផ្ទុកនូវរាល់ការណែនាំទាំងអស់សម្រាប់ការសាងសង់ និងដំណើរការរាងកាយទាំងមូល។
Guanidine thioisocyanate (សារធាតុគីមី Guanidine thioisocyanate)	វាគឺជាសារធាតុគីមីដែលមានឥទ្ធិពលខ្លាំងក្នុងការរំលាយកោសិកា បំផ្លាញប្រូតេអ៊ីននានា (ដែលចង់បំផ្លាញ DNA) និងជួយបង្កើតលក្ខខណ្ឌអំណោយផលឱ្យ DNA អាចតោងជាប់ទៅនឹងជួរឈរស៊ីលីកា។	ដូចជាភ្នាក់ងារសន្តិសុខដែលវាយបំបែកទ្វារផ្ទះ (កោសិកា) ហើយចាប់ចងអ្នកបំផ្លាញចោល មុននឹងជួយម្ចាស់ផ្ទះ (DNA) ឱ្យរត់ទៅតោងទីតាំងសុវត្ថិភាព។
silica particle column (ជួរឈរគ្រាប់ស៊ីលីកា)	វាគឺជាឧបករណ៍សម្រាប់ចម្រោះយក DNA ដែលផ្ទុកនូវគ្រាប់ស៊ីលីកា។ នៅពេលឆ្លងកាត់សារធាតុគីមីជាក់លាក់ ម៉ូលេគុល DNA នឹងតោងជាប់នឹងគ្រាប់ស៊ីលីកាទាំងនេះ ខណៈពេលដែលកាកសំណល់និងប្រូតេអ៊ីនផ្សេងៗទៀតនឹងហូរធ្លាក់ចេញទៅបាត់។	ដូចជាសំណាញ់ត្រងមួយដែលចាប់យកតែគ្រាប់ពេជ្រ (DNA) ហើយបណ្តោយឱ្យទឹកស្អុយនិងកម្ទេចកំទីហូរឆ្លងកាត់បាត់ទៅ។
cell wall-degrading enzyme (អង់ស៊ីមបំបែកជញ្ជាំងកោសិកា)	ពួកវាគឺជាប្រូតេអ៊ីនពិសេស (ដូចជា Lysozyme ឬ Zymolyase) ដែលត្រូវបានប្រើប្រាស់ដើម្បីកាត់ផ្តាច់និងធ្វើឱ្យជញ្ជាំងខាងក្រៅដ៏រឹងមាំរបស់កោសិកាបាក់តេរីឬមេដំបែចុះខ្សោយ ដើម្បីងាយស្រួលទាញយក DNA ពីខាងក្នុង។	ដូចជាកន្ត្រៃកាត់សោទ្វាររបងដ៏រឹងមាំ ដើម្បីឱ្យយើងអាចចូលទៅយករបស់មានតម្លៃនៅខាងក្នុងផ្ទះបាន។
restriction enzyme digestion (ការកាត់ដោយអង់ស៊ីម Restriction)	វាគឺជាដំណើរការនៃការប្រើប្រាស់អង់ស៊ីមពិសេសដើម្បីកាត់ម៉ូលេគុល DNA ជាកង់ៗនៅត្រង់ទីតាំងកូដជាក់លាក់ណាមួយ ដើម្បីត្រួតពិនិត្យមើលគុណភាព DNA ឬសម្រាប់ប្រើក្នុងការបង្កាត់ (Cloning)។	ដូចជាកន្ត្រៃកាត់ខ្សែបូ ដែលកាត់ដាច់តែត្រង់កន្លែងដែលមានពណ៌ ឬសញ្ញាសម្គាល់ជាក់លាក់ណាមួយប៉ុណ្ណោះ។
agarose gel electrophoresis (ការរត់អគ្គិសនីលើជែល Agarose)	វាជាបច្ចេកទេសមន្ទីរពិសោធន៍ដែលប្រើចរន្តអគ្គិសនីដើម្បីរុញម៉ូលេគុល DNA ឱ្យរត់កាត់សន្លឹកជែល ដោយបំបែកនិងចាត់ថ្នាក់ទំហំរបស់ DNA ដែលបំណែកតូចៗនឹងរត់បានលឿននិងឆ្ងាយជាងបំណែកធំៗ។	ដូចជាការប្រណាំងរត់ឆ្លងកាត់ព្រៃស្មៅក្រាស់ ដែលអ្នករត់មាឌតូចៗអាចរត់បានលឿននិងឆ្ងាយជាងអ្នករត់មាឌធំៗ។
plasmid DNA (ផ្លាស្មីត DNA)	វាគឺជាម៉ូលេគុល DNA ជារង្វង់តូចៗដែលប្រទះឃើញមាននៅក្នុងបាក់តេរី ដែលវានៅដាច់ដោយឡែកពី DNA ចម្បងរបស់បាក់តេរី ហើយជារឿយៗវាផ្ទុកហ្សែនដែលអាចទប់ទល់នឹងថ្នាំអង់ទីប៊ីយោទិច។	ដូចជាកាតព័ត៌មានតូចៗបន្ថែមដែលអ្នកដំណើរយកតាមខ្លួន ក្រៅពីសៀវភៅលិខិតឆ្លងដែនចម្បងរបស់ពួកគេ។

៦. ប្រធានបទពាក់ព័ន្ធ (Further Reading)

អត្ថបទដែលបានបោះពុម្ពនៅលើ KhmerResearch ដែលទាក់ទងនឹងប្រធានបទនេះ៖

ប្រធានបទ និងសំណួរស្រាវជ្រាវដែលទាក់ទងនឹងឯកសារនេះ ដែលអ្នកអាចស្វែងរកបន្ថែម៖