Original Title: Improvement of Transformation Efficiency of Agrobacterium Mediated Gene Transfer in Tomato
Source: li01.tci-thaijo.org
Disclaimer: Summary generated by AI based on the provided document. Please refer to the original paper for full scientific accuracy.

ការកែលម្អប្រសិទ្ធភាពនៃការបំប្លែងហ្សែនតាមរយៈ Agrobacterium នៅក្នុងប៉េងប៉ោះ

ចំណងជើងដើម៖ Improvement of Transformation Efficiency of Agrobacterium Mediated Gene Transfer in Tomato

អ្នកនិពន្ធ៖ Supat Attathom (Plant Genetic Engineering Unit, Kasetsart University), Petcharat Siriwong, Wichai Kositratana, Thira Sutabutra

ឆ្នាំបោះពុម្ព៖ 1991 (Kasetsart J. (Nat. Sci.))

វិស័យសិក្សា៖ Agricultural Biotechnology

១. សេចក្តីសង្ខេបប្រតិបត្តិ (Executive Summary)

បញ្ហា (The Problem)៖ ឯកសារនេះផ្តោតលើការកែលម្អប្រព័ន្ធនៃការបំប្លែង និងការបណ្តុះឡើងវិញ (Transformation/regeneration system) សម្រាប់ការផ្ទេរហ្សែនទៅក្នុងរុក្ខជាតិប៉េងប៉ោះ។ ការស្រាវជ្រាវនេះស្វែងរកវិធីសាស្រ្តដែលមានប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់ក្នុងការបង្កើតប៉េងប៉ោះបំប្លែងហ្សែន (Transgenic tomato) ដើម្បីជាមូលដ្ឋានក្នុងការទប់ទល់នឹងជំងឺផ្សេងៗ។

វិធីសាស្ត្រ (The Methodology)៖ ការសិក្សានេះបានប្រើប្រាស់បាក់តេរី Agrobacterium tumefaciens ដើម្បីផ្ទេរហ្សែនទៅក្នុងជាលិកាប៉េងប៉ោះ ដោយធ្វើការប្រៀបធៀបរវាងពូជប៉េងប៉ោះ និងប្រភេទជាលិកាខុសៗគ្នា។

លទ្ធផលសំខាន់ៗ (The Verdict)៖

២. ការវិភាគលើប្រសិទ្ធភាព និងដែនកំណត់ (Performance & Constraints)

វិធីសាស្ត្រ (Method) គុណសម្បត្តិ (Pros) គុណវិបត្តិ (Cons) លទ្ធផលគន្លឹះ (Key Result)
Cotyledon disc transformation
ការបំប្លែងហ្សែនតាមរយៈកូនស្លឹក (Cotyledon disc transformation)
ផ្តល់អត្រាជោគជ័យខ្ពស់ ចំណាយពេលលឿនក្នុងការបណ្តុះកូនរុក្ខជាតិថ្មី (២-៣ សប្តាហ៍) និងងាយស្រួលក្នុងការសម្លាប់មេរោគលើផ្ទៃដោយមិនប៉ះពាល់ដល់កោសិកា។ វាផលិតកូនរុក្ខជាតិបានច្រើនក្នុងមួយជាលិកា។ តម្រូវឱ្យប្រើប្រាស់កូនស្លឹកដែលមានអាយុជាក់លាក់ (ចន្លោះពី ៧ ទៅ ១៤ ថ្ងៃក្រោយពេលបណ្តុះ) ប្រសិនបើកូនស្លឹកចាស់ជាងនេះ ប្រសិទ្ធភាពនៃការបំប្លែងហ្សែននឹងធ្លាក់ចុះយ៉ាងខ្លាំង។ ទទួលបានអត្រាជោគជ័យខ្ពស់ (ឧ. ២៦.០៨% ទៅ ៧៧.១៧% អាស្រ័យលើពូជ) និងបង្កើតកូនរុក្ខជាតិបានពី ១ ទៅ ១០ ដើមក្នុងមួយជាលិកា។
Leaf disc transformation
ការបំប្លែងហ្សែនតាមរយៈបន្ទះស្លឹកធម្មតា (Leaf disc transformation)
ងាយស្រួលក្នុងការប្រមូលជាលិកាស្លឹកពីដើមប៉េងប៉ោះដែលលូតលាស់ហើយសម្រាប់ការយកមកពិសោធន៍។ មានអត្រាជោគជ័យទាប ចំណាយពេលយូរក្នុងការបណ្តុះកូន (៤-៦ សប្តាហ៍) និងងាយរងការខូចខាតកោសិកាដោយសារការកើនឡើងលឿនជ្រុលនៃបាក់តេរី Agrobacterium ទទួលបានអត្រាជោគជ័យទាប (ចន្លោះពី ០% ទៅ ២៦.៦៧%) និងបង្កើតកូនរុក្ខជាតិបានត្រឹម ១ ទៅ ៥ ដើមប៉ុណ្ណោះក្នុងមួយជាលិកា។

ការចំណាយលើធនធាន (Resource Cost)៖ ការស្រាវជ្រាវនេះទាមទារបន្ទប់ពិសោធន៍ជីវបច្ចេកវិទ្យាកសិកម្មកម្រិតមធ្យម ជាមួយនឹងសារធាតុគីមី អ័រម៉ូន និងឧបករណ៍បណ្តុះជាលិកាស្តង់ដារ។

៣. ការពិនិត្យសម្រាប់បរិបទកម្ពុជា/អាស៊ីអាគ្នេយ៍

ភាពលំអៀងនៃទិន្នន័យ (Data Bias)៖

ការសិក្សានេះត្រូវបានធ្វើឡើងនៅសាកលវិទ្យាល័យកសេតសាស្ត្រ ប្រទេសថៃ ដោយប្រើប្រាស់ពូជប៉េងប៉ោះពាណិជ្ជកម្មមួយចំនួនដូចជា Tn #3, VF134-1-2 និង Seeda។ ទោះបីជាថៃនិងកម្ពុជាមានអាកាសធាតុស្រដៀងគ្នាក៏ដោយ ក៏ប្រតិកម្មនៃពូជប៉េងប៉ោះក្នុងស្រុករបស់កម្ពុជា (ឧទាហរណ៍ ពូជនាងអាំ) ទៅនឹងវិធីសាស្ត្រនេះអាចមានភាពខុសគ្នា ដែលទាមទារឱ្យមានការសាកល្បងផ្ទាល់លើពូជក្នុងស្រុក ដើម្បីបញ្ជាក់ពីប្រសិទ្ធភាពពិតប្រាកដ។

លទ្ធភាពនៃការអនុវត្ត (Applicability)៖

វិធីសាស្រ្តនេះមានសក្តានុពលខ្លាំង និងស័ក្តិសមសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍពូជដំណាំនៅកម្ពុជា ជាពិសេសក្នុងការបង្កើតពូជដែលធន់នឹងជំងឺឆ្លង។

ជារួម ការប្រើប្រាស់បច្ចេកទេសបំប្លែងហ្សែនតាមកូនស្លឹកនេះ ជាជំហានដ៏សំខាន់មួយដែលអាចជួយឱ្យស្ថាប័នស្រាវជ្រាវកម្ពុជាបង្កើតពូជដំណាំថ្មីៗប្រកបដោយភាពធន់ និងសក្តានុពលសេដ្ឋកិច្ចខ្ពស់។

៤. ផែនការសកម្មភាពសម្រាប់និស្សិត (Actionable Roadmap)

ដើម្បីអនុវត្តតាមការសិក្សានេះ និស្សិតគួរអនុវត្តតាមជំហានខាងក្រោម៖

  1. សិក្សាមូលដ្ឋានគ្រឹះនៃការបណ្តុះជាលិកា (Master Plant Tissue Culture Basics): និស្សិតត្រូវចាប់ផ្តើមពីការអនុវត្តការបណ្តុះជាលិការុក្ខជាតិធម្មតាដោយប្រើប្រាស់ MS medium និងរៀនពីបច្ចេកទេសសម្លាប់មេរោគលើផ្ទៃជាលិកា (Surface sterilization) ដោយប្រើប្រាស់សូលុយស្យុង Clorox និង Tween-20 ឱ្យបានស្ទាត់ជំនាញសិន។
  2. រៀបចំវ៉ិចទ័រនិងបាក់តេរី (Prepare Agrobacterium and Vectors): ស្វែងយល់ពីរបៀបចិញ្ចឹមបាក់តេរី Agrobacterium tumefaciens នៅក្នុងមជ្ឈដ្ឋាន LB-medium និងការប្រើប្រាស់ Binary vector ដែលមានផ្ទុកហ្សែនសម្គាល់ (Marker genes) ដូចជា NPT-II និង GUS
  3. អនុវត្តការបំប្លែងហ្សែនលើកូនស្លឹក (Perform Cotyledon Disc Transformation): បណ្តុះគ្រាប់ប៉េងប៉ោះក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍រយៈពេល ៧ ទៅ ១៤ ថ្ងៃ ដើម្បីយកកូនស្លឹក (Cotyledon) មកកាត់ជាបន្ទះតូចៗ រួចយកទៅត្រាំជាមួយសូលុយស្យុងបាក់តេរី Agrobacterium រយៈពេល ៥-១០ នាទី រួចផ្តិតឱ្យស្ងួតលើក្រដាសចម្រោះ មុននឹងយកទៅបណ្តុះក្នុងទីងងឹតរយៈពេល ៤៨ ម៉ោង។
  4. ការជ្រើសរើសនិងបណ្តុះកូនរុក្ខជាតិឡើងវិញ (Selection and Regeneration): ផ្ទេរជាលិកាដែលបានឆ្លងបាក់តេរីទៅដាំលើមជ្ឈដ្ឋានដែលមានផ្ទុកថ្នាំអង់ទីប៊ីយោទិច (ឧ. Kanamycin 100 mg/l, Cefotaxime និង Carbenicillin) ដើម្បីរើសយកតែកោសិកាដែលបានបំប្លែងហ្សែនជោគជ័យ និងទប់ស្កាត់ការលូតលាស់ជ្រុលរបស់បាក់តេរី។
  5. ធ្វើតេស្តបញ្ជាក់លទ្ធផល (Verify Gene Expression via GUS Assay): ដើម្បីប្រាកដថាហ្សែនត្រូវបានបញ្ជូលជោគជ័យ ត្រូវប្រើប្រាស់វិធីសាស្ត្រ Histochemical staining ដោយត្រាំជាលិការុក្ខជាតិថ្មីទៅក្នុងសូលុយស្យុង X-GLUC ឆ្លងកាត់យប់ ប្រសិនបើវាប្រែពណ៌ខៀវក្រោមមីក្រូទស្សន៍ នោះបញ្ជាក់ថាការផ្ទេរហ្សែនទទួលបានជោគជ័យ។

៥. វាក្យសព្ទបច្ចេកទេស (Technical Glossary)

ពាក្យបច្ចេកទេស ការពន្យល់ជាខេមរភាសា (Khmer Explanation) និយមន័យសាមញ្ញ (Simple Definition)
Agrobacterium tumefaciens (បាក់តេរី Agrobacterium tumefaciens) ជាប្រភេទបាក់តេរីក្នុងដីដែលមានសមត្ថភាពពីធម្មជាតិក្នុងការកាត់ផ្តាច់ និងបញ្ជូនបំណែកសេនេទិច (DNA) របស់វាទៅក្នុងសេណូមរបស់រុក្ខជាតិ ដែលគេប្រើប្រាស់វាជាយានជំនិះដើម្បីបញ្ជូនហ្សែនដែលគេចង់បានទៅក្នុងកោសិការុក្ខជាតិ។ ដូចជា "អ្នកដឹកជញ្ជូន" ឬ "ប្រៃសណីយ៍" ដែលយកកញ្ចប់ព័ត៌មាន (ហ្សែន) ទៅប្រគល់ និងបញ្ជូលក្នុងរោងចក្រ (កោសិការុក្ខជាតិ)។
Cotyledon disc (បន្ទះកូនស្លឹក) ជាបំណែកជាលិកាដែលកាត់ចេញពីស្លឹកដំបូងបង្អស់របស់កូនរុក្ខជាតិ (កូនស្លឹក) ដែលត្រូវបានគេប្រើប្រាស់ក្នុងការបណ្តុះជាលិកា និងបំប្លែងហ្សែន ដោយសារតែវាមានកោសិកាដែលសកម្មខ្លាំងក្នុងការបែងចែក និងងាយស្រួលលូតលាស់បង្កើតជាកូនរុក្ខជាតិថ្មីវិញ។ ដូចជា "កោសិកាដើម (Stem cells)" របស់ទារកទើបនឹងកើត ដែលមានកម្លាំងលូតលាស់លឿន និងងាយស្រួលបំប្លែងខ្លួនទៅជាសរីរាង្គថ្មីយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព។
Transgenic plant (រុក្ខជាតិបំប្លែងហ្សែន) ជារុក្ខជាតិដែលត្រូវបានគេកែប្រែពូជដោយបញ្ចូលហ្សែនពីសរីរាង្គ ឬរុក្ខជាតិផ្សេងទៀតទៅក្នុងសេណូមរបស់វា ដើម្បីឱ្យវាទទួលបានលក្ខណៈពិសេសថ្មីៗ ដូចជាភាពធន់នឹងសត្វល្អិត ជំងឺ ឬថ្នាំសម្លាប់ស្មៅ។ ដូចជាការដំឡើង "កម្មវិធីថ្មី" (ហ្សែន) ទៅក្នុង "ទូរស័ព្ទចាស់" (រុក្ខជាតិដើម) ដើម្បីឱ្យវាមានសមត្ថភាពថ្មី (ឧទាហរណ៍ ធន់នឹងមេរោគ)។
Binary vector (វ៉ិចទ័រប៊ីណារី) ជាប្រព័ន្ធផ្ទុកហ្សែនដែលផ្សំឡើងពីផ្លាស្មីតពីរផ្សេងគ្នា សម្រាប់ប្រើប្រាស់ជាមួយបាក់តេរី Agrobacterium ដោយមួយផ្ទុកហ្សែនដែលត្រូវផ្ទេរចូលរុក្ខជាតិ (T-DNA) និងមួយទៀតផ្ទុកហ្សែនបញ្ជា (vir genes) ដែលជួយសម្រួលដល់ដំណើរការផ្ទេរហ្សែននេះ។ ដូចជាការបំបែកតួនាទីគ្នា ដោយមួយជា "រ៉ឺម៉កសណ្តោង" សម្រាប់ផ្ទុកទំនិញ (ហ្សែនថ្មី) និងមួយទៀតជា "ក្បាលឡាន" ដែលមានម៉ាស៊ីនទាញ ដើម្បីអូសទំនិញនោះចូលទៅក្នុងគោលដៅ។
GUS (β-glucuronidase) assay (ការធ្វើតេស្តសកម្មភាពអង់ស៊ីម GUS) ជាវិធីសាស្ត្រប្រើប្រាស់ហ្សែនរាយការណ៍ (Reporter gene) ដើម្បីបញ្ជាក់ថាការផ្ទេរហ្សែនទទួលបានជោគជ័យ។ នៅពេលដែលហ្សែននេះសកម្មនៅក្នុងរុក្ខជាតិ វាផលិតអង់ស៊ីមដែលធ្វើឱ្យជាលិការុក្ខជាតិប្រែជាពណ៌ខៀវនៅពេលដាក់ឱ្យប្រតិកម្មជាមួយសារធាតុគីមី X-GLUC។ ដូចជាការលាប "ថ្នាំពណ៌លាក់មុខ" ដែលវានឹងប្រែជាពណ៌ខៀវឱ្យយើងមើលឃើញតែនៅពេលណាដែលកិច្ចការ (ការបញ្ជូលហ្សែន) ត្រូវបានដំណើរការបានជោគជ័យប៉ុណ្ណោះ។
Kanamycin resistant gene (ហ្សែនធន់នឹងថ្នាំកាណាមីស៊ីន) ជាហ្សែនសម្គាល់ (Selectable marker) ដែលគេភ្ជាប់ជាមួយហ្សែនគោលដៅដើម្បីផ្ទេរចូលរុក្ខជាតិ។ វាអនុញ្ញាតឱ្យតែកោសិការុក្ខជាតិណាដែលទទួលហ្សែននេះជោគជ័យប៉ុណ្ណោះ ទើបអាចរស់រានមានជីវិតនិងលូតលាស់នៅលើមជ្ឈដ្ឋានដែលមានថ្នាំអង់ទីប៊ីយោទិច Kanamycin ខណៈកោសិកាដែលបរាជ័យនឹងត្រូវងាប់។ ដូចជាការផ្តល់ "អាវក្រោះការពារគ្រាប់" ដល់ទាហាន; មានតែអ្នកដែលពាក់អាវក្រោះនេះ (ទទួលបានហ្សែនថ្មី) ទេទើបអាចរស់រានមានជីវិតនៅក្នុងតំបន់ដែលមានការបាញ់ប្រហារ (ថ្នាំអង់ទីប៊ីយោទិច)។
Ti-plasmid (ផ្លាស្មីត Ti) ជាខ្សែ DNA រាងជារង្វង់នៅក្នុងបាក់តេរី Agrobacterium ដែលដើមឡើយវាបង្កឱ្យមានដុំសាច់ (Tumor) លើរុក្ខជាតិ។ នៅក្នុងវិស្វកម្មហ្សែន គេបានកាត់ហ្សែនបង្កជំងឺនោះចេញ រួចដាក់ហ្សែនមានប្រយោជន៍ជំនួសវិញ ដោយរក្សាទុកតែយន្តការដឹកជញ្ជូនហ្សែនចូលកោសិការុក្ខជាតិប៉ុណ្ណោះ។ ដូចជាការចាប់យក "វីរុសកុំព្យូទ័រ" មកកែច្នៃ ដោយលុបកូដបំផ្លាញប្រព័ន្ធចោល រួចដាក់កម្មវិធីមានប្រយោជន៍ជំនួសវិញ ដើម្បីប្រើប្រាស់សមត្ថភាពជ្រៀតចូលរបស់វាឱ្យចម្លងកម្មវិធីថ្មីនោះដោយស្វ័យប្រវត្តិ។

៦. ប្រធានបទពាក់ព័ន្ធ (Further Reading)

អត្ថបទដែលបានបោះពុម្ពនៅលើ KhmerResearch ដែលទាក់ទងនឹងប្រធានបទនេះ៖

ប្រធានបទ និងសំណួរស្រាវជ្រាវដែលទាក់ទងនឹងឯកសារនេះ ដែលអ្នកអាចស្វែងរកបន្ថែម៖