Original Title: Development of Tetra-primer ARMS-PCR for Selection and Discrimination of CMD-Resistant Cassava Varieties Used in Thailand
Source: li01.tci-thaijo.org
Disclaimer: Summary generated by AI based on the provided document. Please refer to the original paper for full scientific accuracy.

ការអភិវឌ្ឍបច្ចេកទេស Tetra-primer ARMS-PCR សម្រាប់ការជ្រើសរើស និងការបែងចែកពូជដំឡូងមីធន់នឹងជំងឺ CMD ដែលប្រើប្រាស់នៅប្រទេសថៃ

ចំណងជើងដើម៖ Development of Tetra-primer ARMS-PCR for Selection and Discrimination of CMD-Resistant Cassava Varieties Used in Thailand

អ្នកនិពន្ធ៖ Jeeraporn Kansup (Biotechnology Research and Development Office, Department of Agriculture, Thailand), Suwaluk Sansanee (Rayong Field Crops Research Center, Department of Agriculture, Thailand), Adcharapun Chaicharoen (Biotechnology Research and Development Office, Department of Agriculture, Thailand)

ឆ្នាំបោះពុម្ព៖ 2024, Thai Agricultural Research Journal

វិស័យសិក្សា៖ Agricultural Biotechnology

១. សេចក្តីសង្ខេបប្រតិបត្តិ (Executive Summary)

បញ្ហា (The Problem)៖ ប្រទេសថៃត្រូវការវិធីសាស្ត្រដែលចំណាយតិច និងងាយស្រួលក្នុងការរកមើលសញ្ញាសម្គាល់ម៉ូលេគុល (SNP markers) ដើម្បីជ្រើសរើស និងបែងចែកពូជដំឡូងមី (Manihot esculenta) ចំនួន៧ពូជ ដែលធន់នឹងជំងឺម៉ូសាអ៊ិច (CMD) សម្រាប់កម្មវិធីបង្កាត់ពូជ។

វិធីសាស្ត្រ (The Methodology)៖ ការសិក្សានេះបានរចនា និងធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មដោយប្រើប្រាស់បច្ចេកទេស Tetra-primer ARMS-PCR សម្រាប់ការវិភាគហ្សែន ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណ និងភាពធន់។

ការទាញយក ឌីអិនអេ (DNA Extraction) ពីស្លឹកដំឡូងមីអាយុ៦ខែ ដោយប្រើប្រាស់វិធីសាស្ត្រ CTAB
ការរចនាសំណុំ primer សម្រាប់រកមើលសញ្ញាសម្គាល់ SNP ចំនួន៥រួមមានៈ Ex2-78, Ex2-157, Ex3-128, S12_7926132 និង S12_8910428 (Primer Design)
ការធ្វើប្រតិកម្មពង្រីក ឌីអិនអេ និងការធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវលក្ខខណ្ឌសីតុណ្ហភាព (PCR Amplification and Optimization)

លទ្ធផលសំខាន់ៗ (The Verdict)៖

សំណុំ primer ចំនួន៤ ត្រូវបានអភិវឌ្ឍដោយជោគជ័យសម្រាប់រកមើលសញ្ញាសម្គាល់ SNPs ទាក់ទងនឹងភាពធន់នឹងជំងឺ CMD (Ex2-78, Ex2-157, Ex3-128, S12_7926132) ដែលអាចប្រើដើម្បីជ្រើសរើសពូជដំឡូងមីធន់ទ្រាំ។
សំណុំ primer ទី៥ ត្រូវបានបង្កើតឡើងយ៉ាងជាក់លាក់ដើម្បីរកមើលសញ្ញាសម្គាល់ SNP S12_8910428 ដែលមានសមត្ថភាពអាចបែងចែកពូជ TME B 419 ចេញពីពូជធន់នឹងជំងឺ CMD ចំនួន៦ផ្សេងទៀត។
បច្ចេកទេស Tetra-primer ARMS-PCR ត្រូវបានបញ្ជាក់ថាមានភាពជាក់លាក់ រហ័ស ចំណាយតិច និងងាយស្រួលអនុវត្តដោយប្រើប្រាស់ឧបករណ៍មូលដ្ឋាន សម្រាប់ការបង្កាត់ពូជដំឡូងមីនៅប្រទេសថៃ។

២. ការវិភាគលើប្រសិទ្ធភាព និងដែនកំណត់ (Performance & Constraints)

វិធីសាស្ត្រ (Method)	គុណសម្បត្តិ (Pros)	គុណវិបត្តិ (Cons)	លទ្ធផលគន្លឹះ (Key Result)
Tetra-primer ARMS-PCR បច្ចេកទេស Tetra-primer ARMS-PCR សម្រាប់រកមើលសញ្ញាសម្គាល់ SNP	អាចពង្រីក (Amplify) អាឡែល (Alleles) ច្រើនក្នុងប្រតិកម្មតែមួយ ចំណាយតិច រហ័ស និងងាយស្រួលអនុវត្តដោយប្រើឧបករណ៍មន្ទីរពិសោធន៍មូលដ្ឋាន។	ត្រូវការការធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវសីតុណ្ហភាព (Annealing temperature) និងកំហាប់សារធាតុគីមីជំនួយ (ដូចជា DMSO) យ៉ាងប្រុងប្រយ័ត្នដើម្បីទទួលបានលទ្ធផលច្បាស់លាស់។	អាចកំណត់អត្តសញ្ញាណពូជដំឡូងមីធន់នឹងជំងឺ CMD (SNP Ex2-78) និងបែងចែកពូជ TME B 419 (SNP S12_8910428) យ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព។
Single PCR with SCAR marker (RME1) & SSR marker (SSRY75) បច្ចេកទេស Single PCR ប្រើប្រាស់សញ្ញាសម្គាល់ SCAR និង SSR	ជានីតិវិធីស្តង់ដារដែលធ្លាប់បានបញ្ជាក់រួចមកហើយក្នុងការរកមើលហ្សែនទាក់ទងនឹង CMD2 និងអាចបែងចែកពូជមួយចំនួនបាន។	មិនសូវមានប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់ក្នុងការបែងចែកពូជដែលមានរូបរាង និងលក្ខណៈស្រដៀងគ្នាខ្លាំង ដូចការប្រើប្រាស់ SNP ជាក់លាក់នោះទេ ហើយអាចត្រូវការពេលវេលាច្រើន។	សញ្ញាសម្គាល់ SCAR (RME1) បង្ហាញបន្ទាត់ ឌីអិនអេ ទំហំ 700 bp លើគ្រប់ពូជធន់ ចំណែក SSRY75 អាចបែងចែកបានតែពូជ IITA-TMS-IBA 980505 និង 980581 ប៉ុណ្ណោះ។

ការចំណាយលើធនធាន (Resource Cost)៖ ការសិក្សានេះប្រើប្រាស់ឧបករណ៍មន្ទីរពិសោធន៍ម៉ូលេគុលកម្រិតមូលដ្ឋាន ដែលស័ក្តិសមសម្រាប់ប្រទេសកំពុងអភិវឌ្ឍន៍ ដោយមិនតម្រូវឱ្យមានម៉ាស៊ីនបន្តំលំដាប់ ឌីអិនអេ (DNA sequencing) ថ្លៃៗឡើយ។

Hardware: ម៉ាស៊ីន PCR (GeneAmp® PCR System 9700), ឧបករណ៍វាស់ស្ទង់ពន្លឺ (Spectrophotometer) សម្រាប់វាស់គុណភាព ឌីអិនអេ និងឧបករណ៍រត់ជែល (Agarose gel electrophoresis)។
Software: កម្មវិធីលើបណ្តាញអនឡាញ primer1 សម្រាប់ការរចនាសំណុំ primer និងមូលដ្ឋានទិន្នន័យ Phytozome database សម្រាប់ទាញយកលំដាប់ហ្សែន។
Consumables: សារធាតុគីមីសម្រាប់ស្រង់ ឌីអិនអេ (CTAB method), Taq DNA Polymerase, GoTaq® Green Master Mix, dNTPs, MgCl2 ព្រមទាំងសារធាតុរំលាយ DMSO។
Dataset/Materials: ពូជដំឡូងមីចំនួន៧ ដែលធន់នឹងជំងឺ CMD (នាំចូលពីស្ថាប័នអន្តរជាតិ CIAT និង IITA) និងពូជដែលងាយរងគ្រោះ CMR43-08-89 សម្រាប់ធ្វើជាសំណាកប្រៀបធៀប។

៣. ការពិនិត្យសម្រាប់បរិបទកម្ពុជា/អាស៊ីអាគ្នេយ៍

ភាពលំអៀងនៃទិន្នន័យ (Data Bias)៖

ការសិក្សានេះត្រូវបានធ្វើឡើងនៅមជ្ឈមណ្ឌលស្រាវជ្រាវដំណាំចម្ការខេត្តរ៉ាក់យ៉ង ក្នុងប្រទេសថៃ ដោយប្រើប្រាស់ពូជដំឡូងមីនាំចូលពីស្ថាប័នអន្តរជាតិ (CIAT និង IITA)។ ទិន្នន័យនេះផ្តោតជាចម្បងលើពូជដែលត្រូវបានជ្រើសរើសដើម្បីសម្របទៅនឹងអាកាសធាតុ និងលក្ខខណ្ឌដីនៅប្រទេសថៃ។ សម្រាប់ប្រទេសកម្ពុជា ការស្វែងយល់ពីរបកគំហើញនេះគឺមានសារៈសំខាន់ណាស់ ព្រោះប្រទេសទាំងពីរមានលក្ខខណ្ឌក្សេត្រសាស្ត្រស្រដៀងគ្នា និងប្រឈមនឹងការគំរាមកំហែងពីជំងឺរោគម៉ូសាអ៊ិចដំឡូងមី (CMD) ដូចគ្នា។

លទ្ធភាពនៃការអនុវត្ត (Applicability)៖

បច្ចេកទេស Tetra-primer ARMS-PCR នេះមានប្រយោជន៍ និងសក្តានុពលខ្ពស់ខ្លាំងណាស់សម្រាប់វិស័យកសិកម្មនៅប្រទេសកម្ពុជា។

វិទ្យាស្ថានស្រាវជ្រាវ និងអភិវឌ្ឍន៍កសិកម្មកម្ពុជា (CARDI) ឬសាកលវិទ្យាល័យភូមិន្ទកសិកម្ម (RUA): អាចទទួលយកនីតិវិធីដែលមានតម្លៃថោកនេះ ដើម្បីកសាងសមត្ថភាពក្នុងការវិភាគម៉ូលេគុល និងជ្រើសរើសពូជដំឡូងមីធន់នឹងជំងឺ CMD សម្រាប់ផ្សព្វផ្សាយដល់ប្រជាកសិករក្នុងស្រុក។
ខេត្តផលិតដំឡូងមីធំៗ (ឧ. បាត់ដំបង បន្ទាយមានជ័យ ក្រចេះ និងត្បូងឃ្មុំ): កសិករនៅតំបន់ទាំងនេះជួបប្រទះបញ្ហាជំងឺ CMD យ៉ាងធ្ងន់ធ្ងរ (ខាតបង់ទិន្នផលរហូតដល់ ៨០%)។ ការប្រើប្រាស់ពូជដែលបានបញ្ជាក់ថាធន់តាមរយៈបច្ចេកទេសខាងលើ នឹងជួយសង្គ្រោះទិន្នផល និងសេដ្ឋកិច្ចមូលដ្ឋានបានយ៉ាងច្រើន។
នាយកដ្ឋានការពារដំណាំ អនាម័យ និងភូតគាមអនាម័យ នៃអគ្គនាយកដ្ឋានកសិកម្ម (GDA): អាចប្រើប្រាស់សញ្ញាសម្គាល់ SNP ទាំងនេះជាឧបករណ៍សម្រាប់ផ្ទៀងផ្ទាត់ភាពសុទ្ធនៃពូជដំឡូងមី (Variety discrimination) មុននឹងអនុញ្ញាតឱ្យនាំចូល ឬធ្វើការចែកចាយបន្ត។

ការផ្លាស់ប្តូរមកប្រើប្រាស់ការជ្រើសរើសពូជដោយមានជំនួយពីសញ្ញាសម្គាល់ម៉ូលេគុល (MAS) ដែលចំណាយតិចនេះ នឹងពន្លឿនការអភិវឌ្ឍពូជដំឡូងមីថ្មីៗ ដែលធន់នឹងជំងឺ និងធានាបាននូវសន្តិសុខស្បៀងនៅក្នុងប្រទេសកម្ពុជា។

៤. ផែនការសកម្មភាពសម្រាប់និស្សិត (Actionable Roadmap)

ដើម្បីអនុវត្តតាមការសិក្សានេះ និស្សិតគួរអនុវត្តតាមជំហានខាងក្រោម៖

សិក្សាពីមូលដ្ឋានគ្រឹះនៃការវិភាគម៉ូលេគុលរុក្ខជាតិ: ស្វែងយល់ពីបច្ចេកទេស PCR ជាពិសេសបច្ចេកទេស Tetra-primer ARMS-PCR និងការរកមើលសញ្ញាសម្គាល់ SNP (Single-nucleotide polymorphism) ដោយប្រើប្រាស់ធនធានអនឡាញ ឬឯកសារណែនាំពីគេហទំព័រ NCBI។
អនុវត្តការរចនាសំណុំ Primer តាមប្រព័ន្ធកុំព្យូទ័រ: ចូលទៅកាន់មូលដ្ឋានទិន្នន័យ Phytozome (phytozome-next.jgi.doe.gov) ដើម្បីទាញយកលំដាប់ហ្សែនរបស់ដំឡូងមី (Manihot esculenta) រួចរៀនប្រើប្រាស់កម្មវិធី primer1 (http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html) ដើម្បីសាកល្បងរចនាសំណុំ Primer ដោយខ្លួនឯង។
បណ្តុះបណ្តាលបច្ចេកទេសស្រង់ ឌីអិនអេ ក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍: អនុវត្តការស្រង់ ឌីអិនអេ ពីរុក្ខជាតិ ដោយប្រើវិធីសាស្ត្រ CTAB ដែលជាវិធីសាស្ត្រចំណាយតិចបំផុត ងាយស្រួលរកទិញសារធាតុគីមី និងអាចអនុវត្តបានយ៉ាងល្អនៅតាមមន្ទីរពិសោធន៍ក្នុងស្រុក។
ការធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្ម PCR (PCR Optimization): អនុវត្តជាក់ស្តែងក្នុងការផ្លាស់ប្តូរសីតុណ្ហភាព Annealing temperature (ឧទាហរណ៍៖ ពី ៥៨°C ទៅ ៦៦°C) និងសាកល្បងបន្ថែមសារធាតុ DMSO (០% ទៅ ៣%) ដើម្បីរកមើលលក្ខខណ្ឌល្អបំផុតដែលមិនធ្វើឱ្យបន្ទាត់ ឌីអិនអេ មានភាពមិនច្បាស់។
ការវិភាគទិន្នន័យ និងរាយការណ៍លទ្ធផល: រៀនអាន និងបកស្រាយទំហំបន្ទាត់ ឌីអិនអេ លើជែល Agarose gel electrophoresis ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណហ្សែនធន់ (Genotype GG, TT) ឬហ្សែនងាយរងគ្រោះ មុននឹងសរសេររបាយការណ៍បច្ចេកទេសសម្រាប់ណែនាំដល់កសិករ ឬអ្នកពាក់ព័ន្ធប្រកបដោយទំនុកចិត្ត។

៥. វាក្យសព្ទបច្ចេកទេស (Technical Glossary)

ពាក្យបច្ចេកទេស	ការពន្យល់ជាខេមរភាសា (Khmer Explanation)	និយមន័យសាមញ្ញ (Simple Definition)
Tetra-primer ARMS-PCR (បច្ចេកទេសតំណពង្រីក ARMS ប្រើប្រាស់ Primer បួន)	បច្ចេកទេសនេះប្រើប្រាស់ខ្សែ ឌីអិនអេ ចាប់ផ្តើម (Primer) ចំនួន៤ផ្សេងគ្នា ក្នុងប្រតិកម្មតែមួយ ដើម្បីពង្រីក និងកំណត់រកមើលភាពខុសគ្នានៃ ឌីអិនអេ ទោះបីជាវាខុសគ្នាតែមួយតួអក្សរក៏ដោយ ដែលជួយសន្សំសំចៃពេលវេលា ថវិកា និងមានភាពសាមញ្ញក្នុងការអនុវត្ត។	ដូចជាការប្រើប្រាស់កញ្ចក់ពង្រីក៤ទិសផ្សេងគ្នា ដើម្បីស្វែងរកកំហុសដ៏តូចមួយនៅលើផ្ទាំងគំនូរដ៏ធំមួយក្នុងពេលតែមួយ។
Single-nucleotide polymorphism / SNP (ភាពចម្រុះនៃនូយក្លេអូទីតទោល)	វាគឺជាការផ្លាស់ប្តូរតួអក្សរ ឌីអិនអេ តែមួយគត់ (ឧទាហរណ៍ ពី G ទៅ C) នៅក្នុងលំដាប់ហ្សែន ដែលអ្នកវិទ្យាសាស្ត្រផ្នែកកសិកម្មប្រើវាធ្វើជាសញ្ញាសម្រាប់សម្គាល់លក្ខណៈពិសេសរបស់រុក្ខជាតិ ដូចជាភាពធន់នឹងជំងឺម៉ូសាអ៊ិចជាដើម។	ដូចជាកំហុសអក្ខរាវិរុទ្ធមួយតួអក្សរនៅក្នុងសៀវភៅក្រាស់មួយ ដែលធ្វើឱ្យអត្ថន័យនៃប្រយោគ (លក្ខណៈរុក្ខជាតិ) ផ្លាស់ប្តូរទាំងស្រុង។
Cassava mosaic disease / CMD (ជំងឺម៉ូសាអ៊ិចដំឡូងមី)	ជាជំងឺបង្កដោយវីរុស ដែលវាយប្រហារលើដើមដំឡូងមី បណ្តាលឱ្យស្លឹកឡើងពណ៌លឿងក្ងិញក្ងង់ រួញ ដើមមិនលូតលាស់ និងធ្វើឱ្យទិន្នផលធ្លាក់ចុះយ៉ាងធ្ងន់ធ្ងរនៅទូទាំងពិភពលោក។	ដូចជាជំងឺគ្រុនឈាមលើដំឡូងមី ដែលចម្លងដោយសត្វរុយស និងបំផ្លាញសុខភាពរុក្ខជាតិមិនឱ្យលូតលាស់បាន។
Molecular marker (សញ្ញាសម្គាល់ម៉ូលេគុល)	វាគឺជាបំណែក ឌីអិនអេ ជាក់លាក់ណាមួយដែលគេដឹងទីតាំងច្បាស់លាស់ ហើយគេប្រើវាដើម្បីតាមដាន និងបញ្ជាក់ថាតើរុក្ខជាតិមួយមានលក្ខណៈសម្បត្តិដែលគេចង់បាន (ឧ. ធន់នឹងជំងឺ) ឬអត់ ដោយមិនបាច់រង់ចាំមើលទាល់តែរុក្ខជាតិធំឡើយ។	ដូចជាបាកូដ (Barcode) នៅលើទំនិញ ដែលគ្រាន់តែស្កេនភ្លាម ដឹងពីប្រភព និងគុណភាពទំនិញភ្លាម ដោយមិនបាច់ហែកសំបកមើល។
Allele (អាឡែល ឬទម្រង់ហ្សែន)	វាគឺជាទម្រង់ផ្សេងគ្នានៃហ្សែនតែមួយ ដែលគ្រប់គ្រងលើលក្ខណៈដូចគ្នា។ ក្នុងបរិបទនេះ អាឡែល (ឧទាហរណ៍ អាឡែល T ឬ G) អាចបញ្ជាក់បានថាតើដើមដំឡូងមីនោះអាចទប់ទល់នឹងជំងឺបាន ឬងាយនឹងឆ្លងជំងឺ។	ដូចជាម៉ូដែលរថយន្តតែមួយ ប៉ុន្តែមួយប្រើម៉ាស៊ីនសាំងធម្មតា ឯមួយទៀតប្រើម៉ាស៊ីនកូនកាត់ (Hybrid) ដែលមានសមត្ថភាព និងភាពធន់ខុសគ្នា។
Homozygous (អូម៉ូស៊ីហ្កូត ឬសភាពហ្សែនដូចគ្នា)	ជាស្ថានភាពដែលរុក្ខជាតិទទួលបានទម្រង់ហ្សែន (អាឡែល) ដូចគ្នាបេះបិទពីមេបាទាំងសងខាង ឧទាហរណ៍ដូចជាទម្រង់ TT ឬ GG ដែលធ្វើឱ្យលក្ខណៈរុក្ខជាតិបញ្ចេញមកមានភាពច្បាស់លាស់ និងមានស្ថិរភាព។	ដូចជាការមានស្បែកជើងមួយគូដែលមានម៉ាក ទំហំ និងពណ៌ដូចគ្នាទាំងសងខាងគ្មានខុស។
DNA polymerase delta subunit 1 gene / MePOLD1 (ហ្សែន MePOLD1)	គឺជាហ្សែនជាក់លាក់មួយនៅក្នុង Manihot esculenta ដែលការប្រែប្រួលរបស់វាដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការកំណត់ភាពធន់របស់រុក្ខជាតិទៅនឹងមេរោគម៉ូសាអ៊ិច (CMD2) ហើយវាត្រូវបានប្រើប្រាស់ពិសេសដើម្បីបែងចែកពូជ TME B 419 ពីពូជដទៃ។	ដូចជាមេការត្រួតពិនិត្យគុណភាពនៅក្នុងរោងចក្រកោសិកា ដែលពេលគាត់ផ្លាស់ប្តូររបៀបធ្វើការបន្តិច ធ្វើឱ្យមេរោគមិនអាចលួចចម្លងខ្លួនឯងចូលក្នុងកោសិកាបាន។
Primer (ប្រាយម័រ ឬកូដចាប់ផ្តើម)	ជាខ្សែ ឌីអិនអេ ខ្លីៗដែលគេសំយោគឡើង ដើម្បីប្រើប្រាស់ជាចំណុចចាប់ផ្តើមនៅក្នុងម៉ាស៊ីន PCR សម្រាប់ទៅចាប់យក និងផ្តិតចម្លងតែបំណែកហ្សែនគោលដៅដែលយើងចង់សិក្សា និងធ្វើការវិភាគប៉ុណ្ណោះ។	ដូចជាទំពក់ដែលគេចងនុយជាក់លាក់មួយ ដើម្បីទាក់ទាញ និងចាប់យកតែប្រភេទត្រីដែលគេចង់បានចេញពីបឹងដ៏ធំមួយ។

៦. ប្រធានបទពាក់ព័ន្ធ (Further Reading)

អត្ថបទដែលបានបោះពុម្ពនៅលើ KhmerResearch ដែលទាក់ទងនឹងប្រធានបទនេះ៖

ប្រធានបទ និងសំណួរស្រាវជ្រាវដែលទាក់ទងនឹងឯកសារនេះ ដែលអ្នកអាចស្វែងរកបន្ថែម៖