Original Title: Plant Genome Editing with CRISPR Systems
Source: www.biorxiv.org
Document Type: Textbook / Educational Material
Disclaimer: Summary generated by AI based on the provided document. Please refer to the original material for complete content.

ការកែសម្រួលហ្សែនរុក្ខជាតិដោយប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធ CRISPR

ចំណងជើងដើម៖ Plant Genome Editing with CRISPR Systems

អ្នកនិពន្ធ៖ Yiping Qi (University of Maryland, College Park, MD)

ឆ្នាំបោះពុម្ព៖ 2018 CBC Plant Genome Editing Workshop

វិស័យសិក្សា៖ Plant Biotechnology

១. សេចក្តីសង្ខេប (Overview)

ប្រធានបទ (Topic)៖ ការបង្ហាញនេះផ្តោតលើវិធីសាស្ត្រ វឌ្ឍនភាព និងបញ្ហាប្រឈមក្នុងការកែសម្រួលហ្សែនរុក្ខជាតិ (Plant Genome Editing) ត្រង់ស្គ្រីបតូម (Transcriptome) និងអេពីហ្សែន (Epigenome) ដោយប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធ CRISPR-Cas9 និង CRISPR-Cpf1។

រចនាសម្ព័ន្ធ (Structure)៖ អ្នកស្រាវជ្រាវបានបង្ហាញពីការវិវឌ្ឍនៃប្រព័ន្ធកែសម្រួលហ្សែន ព្រមទាំងវាយតម្លៃប្រសិទ្ធភាព ការពង្រីកគោលដៅ និងផលប៉ះពាល់ក្រៅគោលដៅតាមរយៈការធ្វើតេស្តជាក់ស្តែងលើរុក្ខជាតិផ្សេងៗ។

ការដំឡើងប្រព័ន្ធ CRISPR-Cas9 ចម្រុះដោយគ្មានការប្រើប្រាស់ PCR (PCR-Free Multiplexed CRISPR-Cas9 Assembly)
ការប្រៀបធៀបប្រសិទ្ធភាពនៃប្រូតេអ៊ីន Cpf1 ផ្សេងៗគ្នា (Comparison of LbCpf1, AsCpf1, and FnCpf1)
ការស្ទង់លំដាប់ហ្សែនទាំងមូល (Whole-Genome Sequencing) ដើម្បីពិនិត្យមើលបំរែបំរួលក្រៅគោលដៅ
ការប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធគ្រប់គ្រងប្រតិចារិក (Transcriptional regulation tools) ដូចជា CRISPR-dCas9-SRDX និង VP64

ចំណុចសំខាន់ៗ (Key Takeaways)៖

ប្រព័ន្ធ LbCpf1 បង្ហាញប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់ជាង AsCpf1 ក្នុងការបង្កើតបំរែបំរួលហ្សែនរុក្ខជាតិ ដោយភាគច្រើនបង្កឱ្យមានការលុបបាត់ (Deletions) ទំហំធំពី ៦ ទៅ ១៣ គូគោល (bp)។
ការវិភាគ Whole-Genome Sequencing បង្ហាញថា ស្ទើរតែគ្មានការបំប្លែងក្រៅគោលដៅ (Off-target mutations) ទេ ដោយបំរែបំរួលភាគច្រើនកើតឡើងដោយឯកឯង ឬមកពីដំណើរការបណ្តុះជាលិកា (Tissue culture background mutations)។
ប្រព័ន្ធ CRISPR អាចត្រូវបានកែច្នៃជាឧបករណ៍ដ៏មានសក្តានុពលសម្រាប់បិទ ឬបើកដំណើរការប្រតិចារិកហ្សែន (Transcriptional repressor/activator) ដើម្បីរៀបចំកម្មវិធីអភិវឌ្ឍន៍រុក្ខជាតិនៅក្នុងវិស័យជីវវិទ្យាសំយោគ (Plant Synthetic Biology)។

២. គោលបំណងសិក្សា (Learning Objectives)

បន្ទាប់ពីអានឯកសារនេះ អ្នកគួរអាច៖

ស្វែងយល់ពីយន្តការមូលដ្ឋាន និងភាពខុសគ្នានៃការកែសម្រួលហ្សែនរុក្ខជាតិដោយប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធ CRISPR-Cas9 និង CRISPR-Cpf1 (Understand the mechanisms and differences of plant genome editing using CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cpf1 systems)
វិភាគលើទិន្នន័យនៃការស្ទង់លំដាប់ហ្សែន (Whole-Genome Sequencing) ដើម្បីបែងចែករវាងការបំប្លែងក្រៅគោលដៅ (Off-target mutations) និងបំរែបំរួលដោយសារការបណ្តុះជាលិកា (Tissue culture background mutations)
សិក្សាពីការប្រើប្រាស់ឧបករណ៍គ្រប់គ្រងប្រតិចារិក (Transcriptional regulation tools) ដូចជា dCas9 សម្រាប់កម្មវិធីជីវវិទ្យាសំយោគ (Synthetic Biology) ក្នុងរុក្ខជាតិ

ឯកសារនេះបង្ហាញពីការវិវឌ្ឍនៃបច្ចេកវិទ្យាកែសម្រួលហ្សែនរុក្ខជាតិដោយផ្តោតលើប្រព័ន្ធ CRISPR ជំនាន់ថ្មីៗដូចជា Cas9 និង Cpf1។ វាគ្របដណ្តប់លើបច្ចេកទេសរចនាប្រព័ន្ធចម្រុះ (Multiplexing) ការវាយតម្លៃប្រសិទ្ធភាព ការពង្រីកគោលដៅ PAM ការបង្ហាញភស្តុតាងពីសុវត្ថិភាពទាក់ទងនឹង Off-target ក៏ដូចជាការប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធគ្រប់គ្រងការបញ្ចេញហ្សែនដើម្បីផ្លាស់ប្តូរលក្ខណៈរុក្ខជាតិ។

៣. គោលគំនិតសំខាន់ៗ (Key Concepts)

គោលគំនិត (Concept)	ការពន្យល់ (Explanation)	ឧទាហរណ៍ (Example)
Multiplexed CRISPR-Cas9 System ប្រព័ន្ធ CRISPR-Cas9 ចម្រុះ	ជាវិធីសាស្ត្រក្នុងការដំឡើងខ្សែនាំផ្លូវ (sgRNA) ជាច្រើនបញ្ចូលគ្នាទៅក្នុងវ៉ិចទ័រតែមួយដោយមិនចាំបាច់ប្រើប្រាស់ PCR (PCR-Free Assembly) ដើម្បីធ្វើការកែសម្រួលហ្សែនគោលដៅច្រើនកន្លែងក្នុងពេលតែមួយ។	ការប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធនេះដើម្បីបញ្ជូន sgRNA ពីរក្នុងពេលតែមួយ សំដៅលុបបាត់ហ្សែន microRNA ជាក់លាក់ (Osa-miR408 និង Osa-miR528) នៅក្នុងដំណាំស្រូវ។
CRISPR-Cpf1 System ប្រព័ន្ធកែសម្រួលហ្សែន CRISPR-Cpf1	ជាប្រព័ន្ធកាត់ DNA ជំនាន់ថ្មីដែលប្រើប្រាស់អង់ស៊ីម Cpf1 (ដូចជា LbCpf1, AsCpf1, FnCpf1) ដែលទាមទារទីតាំង T-rich PAM motif (ឧទាហរណ៍ TTTV) ហើយវាបង្កើតស្នាមកាត់បញ្ឆិត (Staggered cleavage) ដែលងាយស្រួលក្នុងការបញ្ចូលហ្សែនថ្មី។	ការរកឃើញថាអង់ស៊ីម LbCpf1 មានប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់ក្នុងការកែហ្សែនស្រូវជាង AsCpf1 ដោយវាភាគច្រើនបង្កើតជាបំរែបំរួលប្រភេទលុបបាត់ (Deletions) ទំហំធំពី ៦ ទៅ ១៣ គូគោល (bp)។
Off-target Mutations Analysis via WGS ការវិភាគបំរែបំរួលហ្សែនក្រៅគោលដៅតាមរយៈ WGS	ជាការប្រើប្រាស់បច្ចេកវិទ្យាស្ទង់លំដាប់ហ្សែនទាំងមូល (Whole-Genome Sequencing) ដើម្បីបញ្ជាក់ថា បំរែបំរួលដែលគេជារឿយៗសង្ស័យថាបង្កដោយ CRISPR តាមពិតភាគច្រើនកើតឡើងដោយឯកឯង និងជាផលប៉ះពាល់ពីដំណើរការបណ្តុះជាលិការុក្ខជាតិ (Tissue culture background mutations)។	ការសិក្សាលើស្រូវជំនាន់ T0 និង T1 បង្ហាញថា ប្រសិនបើគេរចនា sgRNA បានត្រឹមត្រូវ នោះស្ទើរតែគ្មានការបំប្លែងក្រៅគោលដៅ (True off-target mutations) នោះទេ។
Transcriptional Regulation using dCas9 ការគ្រប់គ្រងប្រតិចារិកហ្សែនដោយប្រើ dCas9	បច្ចេកទេសនេះប្រើប្រាស់អង់ស៊ីម Cas9 ដែលបាត់បង់សមត្ថភាពកាត់ DNA (dead Cas9 ឬ dCas9) យកទៅភ្ជាប់ជាមួយប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀត ដើម្បីដើរតួជាឧបករណ៍សម្រាប់បិទ (Repressor) ឬបើក (Activator) ការបញ្ចេញហ្សែនគោលដៅដោយមិនធ្វើឱ្យខូចខាតលំដាប់ DNA ដើមឡើយ។	ការប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធ CRISPR-dCas9-SRDX ដើម្បីទប់ស្កាត់ការបញ្ចេញហ្សែន (Repression) ឬការប្រើប្រព័ន្ធ CRISPR-Act2.0 (ជាមួយ VP64) ដើម្បីជំរុញឱ្យរុក្ខជាតិបញ្ចេញហ្សែនគោលដៅយ៉ាងសកម្ម។

៤. ភាពពាក់ព័ន្ធសម្រាប់កម្ពុជា (Cambodia Relevance)

បច្ចេកវិទ្យាកែសម្រួលហ្សែនរុក្ខជាតិដោយ CRISPR មានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់សម្រាប់កម្ពុជា ក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការប្រែប្រួលអាកាសធាតុ និងការពង្រឹងសន្តិសុខស្បៀងជាតិ។

ការអនុវត្ត (Applications)៖

វិស័យកសិកម្ម និងការអភិវឌ្ឍពូជដំណាំ (Agriculture and Crop Breeding): អ្នកវិទ្យាសាស្ត្រកសិកម្មកម្ពុជាអាចប្រើប្រាស់បច្ចេកវិទ្យា CRISPR ដើម្បីកែសម្រួលពូជស្រូវក្នុងស្រុក (ដូចជាផ្ការំដួល) ឱ្យកាន់តែមានភាពធន់នឹងគ្រោះរាំងស្ងួត ឬបង្កើតពូជស្រូវកូនកាត់ Two-line Hybrid Rice (ដូចឧទាហរណ៍កែហ្សែន CSA នៅក្នុងឯកសារ) ដើម្បីបង្កើនទិន្នផល។
ការស្រាវជ្រាវជីវបច្ចេកវិទ្យានៅសាកលវិទ្យាល័យ (Biotechnology Research in Universities): ស្ថាប័នអប់រំនៅកម្ពុជាអាចបញ្ជ្រាបចំណេះដឹងផ្នែកជីវវិទ្យាសំយោគ (Synthetic Biology) និងប្រព័ន្ធ dCas9 ទៅក្នុងកម្មវិធីសិក្សា ដើម្បីជំរុញការស្រាវជ្រាវក្នុងការគ្រប់គ្រងជំងឺរុក្ខជាតិ ដូចជាជំងឺម៉ូសាអ៊ិចលើដំឡូងមី ដោយប្រើឧបករណ៍ទប់ស្កាត់ហ្សែន (Transcriptional Repressor)។

ការចាប់យកចំណេះដឹងស្តីពីបច្ចេកវិទ្យា CRISPR និងការរចនាហ្សែនកម្រិតខ្ពស់នេះ នឹងជួយកសាងធនធានមនុស្សនៅកម្ពុជាឱ្យមានសមត្ថភាពចូលរួមក្នុងការអភិវឌ្ឍវិស័យកសិកម្មទំនើប និងជីវបច្ចេកវិទ្យាប្រកបដោយនិរន្តរភាព។

៥. មគ្គុទ្ទេសក៍សិក្សា (Study Guide)

លំហាត់ និងសកម្មភាពសិក្សាដើម្បីពង្រឹងការយល់ដឹង៖

ការរចនា sgRNA សម្រាប់ហ្សែនដំណាំស្រូវ (Designing sgRNA for Rice Genes): និស្សិតត្រូវប្រើប្រាស់មូលដ្ឋានទិន្នន័យហ្សែនស្រូវ (ឧ. Rice Genome Annotation Project) រួមជាមួយកម្មវិធី Bioinformatics លើអនឡាញ (ដូចជា CHOPCHOP ឬ CRISPR-P) ដើម្បីអនុវត្តរចនាខ្សែនាំផ្លូវ sgRNA ដោយផ្តោតលើប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់ និងកាត់បន្ថយហានិភ័យ Off-target ឱ្យនៅទាបបំផុត។
ការវិភាគប្រៀបធៀបរវាង Cas9 និង Cpf1 (Comparative Analysis of Cas9 and Cpf1): បែងចែកនិស្សិតជាក្រុម ដើម្បីសិក្សាស្រាវជ្រាវ និងធ្វើបទបង្ហាញពីភាពខុសគ្នារវាងប្រព័ន្ធ SpCas9 (ដែលត្រូវការ NGG PAM) និង Cpf1 (ដែលត្រូវការ TTTV PAM) ដោយផ្តោតលើភាពខុសគ្នានៃទម្រង់កាត់ផ្តាច់ (Blunt vs. Staggered ends) និងអត្រានៃបំរែបំរួល។
ការសិក្សាពីផលប៉ះពាល់នៃការបណ្តុះជាលិកា (Tissue Culture Background Mutations Case Study): ផ្តល់ទិន្នន័យក្រាហ្វិកពីការសិក្សា (ដូចក្នុងស្លាយទី ៣២-៣៣) ឱ្យនិស្សិតវិភាគ ដើម្បីទាញសេចក្តីសន្និដ្ឋានអំពីមូលហេតុពិតប្រាកដដែលបណ្តាលឱ្យមានបំរែបំរួលហ្សែនច្រើននៅក្នុងរុក្ខជាតិដែលត្រូវបានកែសម្រួល (បញ្ជាក់ពីការបំបែករវាង Background mutations និង True CRISPR off-targets)។
គម្រោងនិម្មិត៖ ការបង្កើតប្រព័ន្ធទប់ស្កាត់ហ្សែន (Mock Project: Designing a Transcriptional Repressor): ឱ្យនិស្សិតសរសេរសំណើគម្រោងស្រាវជ្រាវខ្នាតតូចមួយ ដោយជ្រើសរើសហ្សែនបង្កជំងឺ ឬហ្សែនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងភាពចាស់របស់រុក្ខជាតិណាមួយ រួចពណ៌នាពីរបៀបប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធ CRISPR-dCas9-SRDX ដើម្បីទប់ស្កាត់ (Repress) ហ្សែននោះមិនឱ្យបញ្ចេញសកម្មភាព។

៦. វាក្យសព្ទបច្ចេកទេស (Technical Glossary)

ពាក្យបច្ចេកទេស (English)	ការពន្យល់ជាខេមរភាសា (Khmer Explanation)	និយមន័យសាមញ្ញ (Simple Definition)
CRISPR-Cas9	វាជាប្រព័ន្ធបច្ចេកវិទ្យាកែសម្រួលហ្សែនដ៏មានប្រសិទ្ធភាព ដោយប្រើប្រាស់ប្រូតេអ៊ីន Cas9 ជាអង់ស៊ីមសម្រាប់កាត់ផ្តាច់ខ្សែ DNA នៅទីតាំងជាក់លាក់ណាមួយ ដើម្បីលុបបាត់ (Knockout) ឬបញ្ចូលព័ត៌មានសេនេទិចថ្មីទៅក្នុងសែនូមរបស់រុក្ខជាតិ។	ដូចជាកន្ត្រៃវេទមន្តដែលអាចកាត់កែអក្ខរាវិរុទ្ធខុសនៅក្នុងសៀវភៅក្រាស់មួយក្បាល (តំណាងឲ្យ DNA) បានយ៉ាងសុក្រឹត និងចំគោលដៅ។
gRNA (guide RNA)	ជាម៉ូលេគុល RNA ខ្លីមួយដែលត្រូវបានរចនាឡើងយ៉ាងពិសេស ដើម្បីដើរតួជាអ្នកនាំផ្លូវអង់ស៊ីម Cas9 ឬ Cpf1 ទៅកាន់ទីតាំងហ្សែនគោលដៅនៅលើខ្សែ DNA ដើម្បីធ្វើការកាត់ផ្តាច់។ បើគ្មាន gRNA ទេ អង់ស៊ីមមិនដឹងថាត្រូវកាត់នៅត្រង់ណាឡើយ។	ដូចជាកម្មវិធីផែនទី (Google Maps) ឬ GPS ដែលចង្អុលបង្ហាញផ្លូវឱ្យកន្ត្រៃ Cas9 ធ្វើដំណើរទៅកាត់ DNA ត្រូវកន្លែង។
PAM (Protospacer Adjacent Motif)	វាជាលំដាប់កូដ DNA ខ្លីមួយ (ឧទាហរណ៍ កូដ NGG សម្រាប់ Cas9 ឬ TTTV សម្រាប់ Cpf1) ដែលស្ថិតនៅជាប់នឹងទីតាំងគោលដៅ។ អង់ស៊ីមកាត់ DNA ត្រូវការលំដាប់ PAM នេះជាចាំបាច់ដើម្បីសម្គាល់ និងចាប់ផ្តើមសកម្មភាពកាត់ បើគ្មានវាទេ ការកាត់មិនអាចប្រព្រឹត្តទៅបានឡើយ។	ដូចជាសោរពាក្យសម្ងាត់ (Password) ឬលេខកូដទ្វារ ដែលអ្នកត្រូវតែមាន ទើបអាចបើកទ្វារចូលទៅកាត់តហ្សែននៅទីតាំងនោះបាន។
NHEJ (Non-homologous end joining)	ជាយន្តការជួសជុល DNA តាមបែបធម្មជាតិរបស់កោសិការុក្ខជាតិ បន្ទាប់ពីខ្សែ DNA ត្រូវបានកាត់ផ្តាច់ដោយ CRISPR។ ដំណើរការជួសជុលនេះច្រើនតែប្រព្រឹត្តទៅដោយគ្មានភាពសុក្រឹត ដែលបណ្តាលឱ្យមានការបាត់បង់ ឬបន្ថែមមូលដ្ឋាន DNA មួយចំនួន (Indels) ធ្វើឱ្យហ្សែននោះលែងដំណើរការ។	ដូចជាការយកកាវទៅបិទភ្ជាប់បំណែកកែវដែលបែកភ្លាមៗដោយប្រញាប់ប្រញាល់ ដែលធ្វើឱ្យស្នាមតភ្ជាប់មិនសូវស្អាត និងខុសរាងពីដើមបន្តិចបន្តួច។
Off-target mutations	ជាការកាត់ផ្តាច់ និងបំប្លែងហ្សែនខុសគោលដៅ ដែលកើតឡើងនៅពេលអង់ស៊ីម Cas9 ឬ Cpf1 ច្រឡំទៅចាប់ផ្តើមកាត់ទីតាំងផ្សេងទៀតនៅក្នុងសែនូម ដោយសារតែទីតាំងនោះមានទម្រង់កូដ DNA ស្រដៀងគ្នានឹងហ្សែនដែលយើងចង់កែ។	ដូចជាការផ្ញើកញ្ចប់ឥវ៉ាន់ទៅខុសផ្ទះ ដោយសារតែអាសយដ្ឋានផ្ទះនោះមានឈ្មោះស្រដៀងគ្នានឹងផ្ទះដែលយើងចង់ផ្ញើទៅពិតប្រាកដ។
dCas9 (dead Cas9)	ជាប្រភេទអង់ស៊ីម Cas9 ដែលត្រូវបានកែច្នៃបំបាត់សមត្ថភាពក្នុងការកាត់ផ្តាច់ DNA (អសកម្ម) ប៉ុន្តែវានៅតែអាចទៅតោងជាប់នឹងទីតាំងហ្សែនគោលដៅដដែល។ គេប្រើវាភ្ជាប់ជាមួយប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀត ដើម្បីប្រើជាឧបករណ៍ទប់ស្កាត់ (Repressor) ឬជំរុញ (Activator) ការបញ្ចេញហ្សែនដោយមិនធ្វើឱ្យខូច DNA ដើមឡើយ។	ដូចជាឆ្មាំយាមទ្វារដែលគ្រាន់តែឈរបិទផ្លូវយ៉ាងជិតមិនឱ្យគេដើរចេញចូលបាន ប៉ុន្តែគាត់មិនបានវាយបំផ្លាញទ្វារនោះចោលទេ។
Whole-Genome Sequencing (WGS)	ជាបច្ចេកវិទ្យាសម្រាប់អាន និងផ្តិតយកលំដាប់កូដ DNA ទាំងអស់របស់រុក្ខជាតិ (សែនូមទាំងមូល) ដើម្បីយកមកធ្វើការវិភាគ និងប្រៀបធៀបស្វែងរកបំរែបំរួលហ្សែន ថាតើការកែសម្រួលពិតជាត្រឹមត្រូវតាមគោលដៅ ឬមានការខុសឆ្គងនៅកន្លែងណាមួយឬអត់។	ដូចជាការថតចម្លង (Scan) ឬអានសៀវភៅទាំងមូលគ្រប់ទំព័រ ដើម្បីយកមកពិនិត្យមើលថាមានអក្សរណាខុសខ្លះ បើធៀបនឹងសៀវភៅច្បាប់ដើម។
Multiplexed CRISPR-Cas9	ជាបច្ចេកទេសប្រមូលផ្តុំ និងដំឡើងខ្សែ gRNA ជាច្រើនទៅក្នុងប្រព័ន្ធឬវ៉ិចទ័រតែមួយ ដើម្បីកែសម្រួលហ្សែនច្រើនកន្លែង (Multiple loci) ឬកែប្រែមុខងារច្រើនក្នុងពេលតែមួយនៅក្នុងរុក្ខជាតិ ជំនួសឱ្យការធ្វើម្តងមួយៗដែលចំណាយពេលយូរ។	ដូចជាការប្រើប្រាស់ព្រួញច្រើនដើមបាញ់ចេញពីធ្នូតែមួយក្នុងពេលតែមួយ ដើម្បីកម្ចាត់គោលដៅច្រើនផ្សេងៗគ្នាក្នុងពេលតែមួយ។

៧. ប្រធានបទពាក់ព័ន្ធ (Further Reading)

អត្ថបទដែលបានបោះពុម្ពនៅលើ KhmerResearch ដែលទាក់ទងនឹងប្រធានបទនេះ៖

ប្រធានបទ និងសំណួរស្រាវជ្រាវដែលទាក់ទងនឹងឯកសារនេះ ដែលអ្នកអាចស្វែងរកបន្ថែម៖